物理化学研究所 科学技术振兴机构 阐明毛囊干细胞的发生起源 - -提倡在筒状分区诱导干细胞的“伸缩镜模型”
理化学研究所(理研)生命机能科学研究中心细胞外环境研究小组的森田梨津子研究员、藤原裕展小组组长等研究小组表明，毛囊[1]的干细胞来源于与以往定论不同的细胞，通过与已知机制不同的机制进行诱导。 根据这个发现，提出了能够同时进行构成毛囊的细胞分区和干细胞诱导的新形态形成模型“伸缩镜模型”。 本研究成果是推翻毛囊干细胞[1]发生起源定论的发现，有望成为干细胞生物学及再生医疗研究的新基础知识。 另外，伸缩镜模型有可能成为各种生物体表器官通用的干细胞诱导原理，有望带来超越领域的巨大影响。 这次，研究小组的目标是，使用在1细胞水平上随时间观察小鼠毛囊发生的长期ex vivo实时成像[2]和1细胞转录分析[3]相结合的独特的数据驱动型方法[4]，明确毛囊干细胞的发生起源 结果发现，产生中的毛囊被划分为筒状，未来的干细胞由其分区之一诱导，另外这些分区在毛囊形成前的上皮[5]片中作为同心圆环状的细胞预模式存在。 然后，望远镜从环状的细胞预模式延伸出来，形成筒状的区域，这样的毛囊发生结构被命名为“伸缩镜模型”。 本研究刊登在科学杂志《Nature》在线版( 6月9日:日本时间6月10日)上。 -
毛囊干细胞的发生起源(红色)和新的毛囊发生模型“伸缩镜模型” (插图:奈良岛知行) -
图1小鼠毛囊发生的示意图 毛囊采取上皮陷入内部形成的筒状结构。 胎儿期形成的毛囊，通过毛囊干细胞的作用，可以在一生中反复退缩和再生。 成体毛囊干细胞通过SOX9和LHX2等标记基因的表达可以与其他细胞区别，但由于这些基因在发生过程的各种细胞中表达，认为很难依靠成体干细胞标记基因跟踪干细胞的发生起源。注1)藤原，h .，翠屏，K. & Morita，r . .多任务表皮干细胞:超越表皮维持。发展增长差异60，531-541，doi:10.1111/dgd.12577 (2018)。注2)邬斯宾斯卡娅，t .，马托斯，I .，默茨，A. F .，菲奥雷，V. F. &富克斯，e . WNT-SHH拮抗作用在小生境形成之前指定和扩大干细胞。Cell 164，156-169，doi:10.1016/j . cell . 2015 . 11 . 058(2016)。
研究方法和成果 研究小组新开发了能够以1细胞分辨率随时间观察毛囊发生的长期ex vivo实时成像。 并且，通过进行结合了1细胞转录组分析的多组学数据[4]的综合分析，可以用前所未有的分辨率和精度分析发生期毛囊中①各个毛囊细胞的三维位置和动态、②细胞的发生谱系、③使以前所未有的分辨率和精度分析各细胞谱系的基因表达变化成为可能。1 )通过长期ex vivo实时成像鉴定小鼠毛囊干细胞的起源 首先，新确立了在生物体外( ex vivo )再现小鼠脸颊和背部毛囊发生的器官培养方法，拍摄了以1细胞水平的分辨率捕捉毛囊发生过程的视频。 如果追溯观察这个视频的时间，就会知道构成毛囊的各细胞最初是在哪个位置。 对毛囊构成细胞进行了连续、全面的跟踪，结果表明，在筒状形态形成开始的发生初期的毛囊中，细胞命运不同的分区已经确立，毛囊由该各分区伸长而发生，并且将来成为干细胞的细胞由毛芽期毛囊的上部区域诱导而来的(图2 )。图2毛囊发生的长期ex vivo实时成像和毛囊干细胞发生谱系的鉴定 a .小鼠胎龄1~3日毛芽期毛囊对毛细胞性毛桩期(毛囊获得桩状细长形态的时期)的实时成像(上)和上皮细胞的追溯结果(下)。 将来成为干细胞的细胞(红箭头)存在于毛芽期毛囊的上部，不会移动到其他细胞区域(黄、蓝)。 标尺为100微米( μm，1μm为1，000分之1mm )。 b .在生物体外产生的毛囊在成体毛包干细胞标记(绿色、红色)处的免疫染色像。 标尺为50μm。接着，追溯到毛芽期毛囊之前的毛囊发生的开始期进行观察。 这个时期的毛囊预定区域还没有从皮肤陷入，而是采取了被称为普拉码的二维上皮片(毛囊普拉码)结构。 观察结果表明，毛囊多普勒编码中呈同心圆环状配置有不同谱系的细胞群，将来成为干细胞的细胞来自位于毛囊多普勒编码边缘的SOX9阳性基底细胞的环(图3 )。 以前的定论是，由基底细胞的不对称分裂产生的SOX9阳性的基底上层细胞被认为是毛囊干细胞的起源，但该细胞只产生分化细胞，无助于干细胞领域(图3 )。图3毛囊干细胞预定发生区域的鉴定 a .胎龄12日小鼠从多普勒编码期到毛芽期毛囊发生的实时成像(上)。 通过追溯追踪毛期各区域的细胞运动，可以知道各个多普勒编码期的预定发生区域(下)。 毛囊多普勒编码中有不同的上皮细胞谱系同心排列，将来成为干细胞的细胞存在于毛囊多普勒编码边缘的基底层(红箭头)。 在前期研究中，被认为是干细胞起源的基底上层细胞(水色丸)，在毛芽期分散在表皮内，对毛囊的发生几乎没有贡献。 标尺为50μm。 b .统计了存在于普拉编码期的基底层及基底上层的细胞在毛芽期毛囊中存在于哪里。 已确认完全离开基底层的基上层细胞(水色丸)在毛芽期不会再次返回基底层(成体干细胞存在的细胞层)。 c .毛囊多普勒编码中存在着SOX9表达强度不同的2种细胞。 在前期研究中被认为是干细胞起源的基底上层细胞(浅蓝色箭头)高表达SOX9，本研究明确的干细胞预定区域的基底细胞中度表达SOX9(红箭头)。 标尺为50μm。另外，根据包罗性且连续的细胞谱系数据表明，毛囊普拉码上的同心圆环区域向体内侧凹陷，且各区域沿长轴方向伸长，从而形成三维筒状的分区结构。 而且还发现，胎儿期的毛囊干细胞对这个过程中的毛囊形成几乎没有贡献。 这与成体毛囊干细胞再生毛周期退缩的毛囊区域的结构大不相同。2 ) 1细胞转录组分析干细胞诱导过程 接着，为了了解毛囊细胞在发生过程中的状态变化，进行了历时1细胞的转录分析。 由于发生期的皮肤中混入了发生阶段不同的各种类型的毛囊，所以只需将皮肤片切出来分离细胞，就会混入阶段不同的毛囊细胞。 于是，开发了在全身细胞核表达光转换型荧光蛋白质KikGR[11]的基因改变小鼠，通过在显微镜下仅标记特定发生阶段的毛囊，成功地高精度分离出了同一时期毛囊整体的上皮细胞(图4A )。 从经时取得的各发生阶段的细胞中，采用理研独自技术注3 )即1细胞完全长度总RNA序列法“ramda-seq”[ 12 ]，取得了1细胞转录数据。 根据转录数据重建了细胞谱系和各个细胞在组织内的时空构型(图4B )，结果表明，毛囊多普勒编码中存在与实时成像得到的细胞谱系模式一致的同心圆环状的基因表达模式(图4C ) 进一步研究表明，随着发生阶段的发展，同心圆各环的特征性多个基因会改变其表达区域，以适应同心圆图案到筒状毛囊各分区的发展(图4D )。图4毛囊上皮细胞的包罗性1细胞转录组分析 a .用光转换型荧光蛋白KikGR标记的毛囊。 标尺为50μm。 b .发生期毛囊上皮细胞的全面性疑似时间序列分析。 利用各发生阶段毛囊上皮细胞的1细胞转录数据，在三维空间上的位置表现出各个细胞的基因表达特征。 具有相似特征的细胞在同一位置组成簇。 以胎龄11.5日预编码期(赤丸)为起点，经过胎龄12日预编码期(橙丸)，细胞命运逐渐分支，每个细胞谱系分化成熟的情况。 蓝箭头表示成毛细胞的分支点，黄箭头表示毛囊干细胞的分支点。 c .胎龄12.0日毛囊上皮细胞来源的1细胞转录组的详细分析。 (左)在由基因表达模式模拟重构的空间中排列1细胞转录数据，结果发现表达基因从毛囊多普勒编码的中心部向边缘部、毛囊间表皮细胞变化的情况。 (右上)在模拟重构的空间中，针对从多普勒编码中心向边缘显示不同表达模式的3个基因，确认了其在实际毛囊多普勒编码上的表达模式(箭头)，以Bmp2的表达为中心观察到了环状的表达模式。 (右下)毛囊编码中表达的代表性基因的表达模式总结。 标尺为100μm。 d .在毛囊普拉码上显示环状的表达模式的Sox9，在发生发展的毛囊中变得显示圆筒状的表达模式。 标尺为50μm。并且，成体毛包干细胞的性质显示，通过毛囊的形态形成过程逐渐获得，以及在多普勒编码期形成的BMP[13]活性高、Wnt[13]活性低的区域维持、扩大，可能会产生毛囊干细胞被诱导的情况。 由以上结果可知，毛囊多普勒编码中同心圆状地配置有具有不同基因表达模式、分化为不同细胞的上皮细胞，该多普勒编码上的同心圆图案向体内侧凹陷，各区域沿长轴方向伸长，从而制成三维筒状的毛囊结构 研究小组将这个伸缩式望远镜延伸产生的毛囊形态形成模式命名为“伸缩镜模型”(图5 )。 这与果蝇[14]胚胎发生中肢原基[14]的形成机制也很相似，因此有可能是哺乳类以外的生物物种器官发生中通用的普遍形态形成系统。 胎儿期的毛囊干细胞是在与这种形态形成系统密切合作的同时产生的，在出生后的毛囊再生中起着中心作用。图5毛囊干细胞的发生起源和新的毛囊发生模型“伸缩镜模型” 毛囊多普勒编码中已经存在具有不同基因表达和细胞命运的上皮细胞呈同心圆状配置的毛囊的前型。 其中，从毛囊普拉码边缘的BMP活性高、Wnt活性低的区域诱导未来的毛囊干细胞。 该标语线上的同心圆图案随着产生而陷入体内侧，各区域沿长轴方向伸长，从而形成三维筒状的分区，形成毛囊结构。注3 ) 2018年2月14日新闻发布会“从1个细胞中测量各种各样的RNA的行为”今后的期待 本成果在基础和应用两方面有望今后得到发展。 在基础面，自然会阐明产生和维持干细胞的干细胞的微小环境“干细胞二进制”。 迄今为止，由于干细胞的起源和之后的族谱不清楚，因此其利基很难解析。 通过此次技术开发，除了干细胞预定细胞的动态和状态变化外，还可以鉴定与它们一同行为的周围细胞，并详细分析其基因表达。 另一个重要的课题是，调查伸缩镜模型是否是和毛囊一样由普拉码产生的其他体表器官(乳腺和汗腺等)的产生和干细胞诱导机构中共通的结构。 通过分析这些器官，有可能逼近贯穿器官和生物物种的普遍形态形成系统。 在应用方面，来自ES细胞[16]和iPS细胞[16]等多能干细胞的毛囊干细胞诱导增殖分化的控制技术有望发展。 本研究表明，毛囊干细胞正确的细胞谱系及其基因表达变化。 通过将这些信息制成由多能干细胞分化的状态路线图，从而提高了从ES/iPS细胞高效分化诱导高质量毛囊干细胞的可能性。补充说明 1 .毛囊、毛囊干细胞 毛囊是指产生毛的哺乳类皮肤附属器官。 老鼠等啮齿类动物的毛囊的发生，从胎儿期的表皮开始经过普拉编码期、毛芽期，在出生后两周内完成。 毛囊干细胞是构成毛囊提供细胞的来源细胞，已知存在于毛囊被称为凸起的区域。 干细胞兼具长期的自我复制能力和产生各种细胞的多分化能力。 2.ex视频实时成像 对从生物体外取出的活细胞组织的活动进行经时观察。 ex vivo是指“在生物体外”的用语。 用绿色荧光蛋白质( GFP )等荧光标记标记特定的细胞和组织，可以用荧光显微镜详细观察其运动和变化。 3.1细胞转录体分析 一种利用高通量DNA序列仪对1个细胞中从DNA转录的RNA进行测序，包罗性、定量性地决定其量和种类并进行分析的方法。 可以一下子得到一个细胞数百至数千个基因的表达信息。 4 .数据驱动型方法、多维数据 数据驱动型方法是相对于根据假设验证进行实验的假设驱动型方法，从关于研究对象的生命现象的精密且大量的系统数据的分析中获得新知识的研究方法。 本研究取得并分析了从1个细胞水平跟踪毛囊发生过程的细胞的四维动态(三维+时间轴)，以及从1个细胞水平的基因表达变化的多个包罗性数据(多维数据)。 5 .上皮、基底细胞、基底上层细胞 包围体表的上皮由多层化的数层上皮细胞构成。 将与基底膜相接的最下层称为基底层，将构成基底层的细胞称为基底细胞，将构成基底细胞上层的细胞称为基底上层细胞。 6 .标记基因 表示特定状态下细胞特征性表达的基因称为标记基因，用于正确把握细胞周期和细胞分化的进度等。 7 .遗传学细胞谱系分析 一种通过基因重组给特定的细胞永久地标记或着色，然后跟踪该细胞和由此产生的所有细胞的方法。 可以解析细胞的系谱(家谱)。 利用Cre重组酶识别loxP序列诱导DNA重组的机制，在表达特定基因的细胞中表达荧光蛋白质等的方法正在广泛应用。 8 .标语线 是指在感觉器官等预定发生区域形成的肥厚上皮组织结构。 毛囊、眼睛、耳朵、乳腺、羽毛等都由普拉码形成。 9 .不对称分裂 分裂产生的两个细胞(女儿细胞)经历不同的命运时，其分裂称为非对称分裂。 另一方面，走向同样命运的情况被称为对称分裂。 10 .转录因子，SOX9 转录因子是与DNA结合，控制特定基因表达的蛋白质。 SOX9是转录因子之一，在哺乳类的器官发生等方面具有重要作用。 编码SOX9的小鼠基因表示为SOX9。 11 .光转换荧光蛋白质KikGR 荧光蛋白质中，因特定波长的强光照射而荧光颜色发生变化的蛋白质被称为光转换荧光蛋白质。 KikGR是珊瑚荧光蛋白质的变异体，由理研的宫胁敦史博士的小组开发。 照射紫外光或蓝紫光时，发出的荧光从绿色变为红色。 12.1细胞完全长度总RNA序列法“RamDA-seq” 由理研的二阶堂爱博士小组开发的、用1个细胞高灵敏度、高精度地测量多种RNA表达量和全长的方法。 RamDA-seq (拉姆达塞克)是随机置换应用程序序列的缩写。 13.BMP、Wnt 都是分泌性蛋白质，除了与干细胞增殖和分化的控制有关外，还与初期发生和癌症等多种生命现象有关。 BMP是骨骼生长保护的缩写。 Wnt由果蝇的基因wingless和小鼠乳腺癌基因int-1命名。 14 .果蝇、肢原基 果蝇是常用于基因胚胎发生研究等的昆虫。 肢基是苍蝇肢的基础——不成熟的二维上皮组织。 在伸长前的肢原基上形成同心圆状的细胞命运地图，它们分化为肢的顶端、中间、根部。 15 .干细胞尼奇 是包围干细胞的干细胞固有的微环境，可以说是干细胞的摇篮。 尼奇通过向干细胞发送信号，控制干细胞的诱导、维持和分化。 在生物体外培养干细胞时，有时也会使用利基的成分。 16.ES细胞、iPS细胞 ES细胞(胚胎干细胞)是由存在于哺乳类着床前胚(胚盘胞)的多能干细胞(内部细胞块)建立的细胞。 iPS细胞(人工多能干细胞)是通过向体细胞导入特定基因而获得分化多能性的细胞。研究小组 理化学研究所生命机能科学研究中心 细胞外环境研究小组 研究员森田梨津子 技术人员三千典子 技术人员佐佐木弘子 队长藤原裕展 生物信息学研究开发小组 工程师林哲太郎 技术人员梅田茉奈(梅田茉奈) 专业技术员芳村美佳 队长二阶堂爱 生物基因组工程研究小组 队长(研究当时)古田泰秀(古田泰秀) (现酷睿头，鼠标通用核心设施，局域网密钥中心) 生物模型开发小组 技师阿部高也 队长清成宽(清成宽) 物理生物学研究小组 研究员(研究当时)山本尚贵(山本风贵) (现生物体非平衡物理学理研究所白眉研究小组研究员) 队长柴田达夫(柴田达夫)研究支援 本研究由理化学研究所运营费补助金(生命功能科学研究、跨领域合作研究“一细胞项目”)、 科学技术振兴机构( JST )战略性创造研究推进事业CREST“以理解多细胞之间的时空相互作用为目标的定量解析基础的创造(研究总结:松田道行)”领域的研究课题“阐明创造体表多样性的上皮-间充织相互作用的动态控制机构(研究代表者:藤原裕展)”、AMED创 科学研究费补助金青年研究( b )“细胞外环境依存性毛囊干细胞恒定性维持机制的阐明(研究代表者:森田梨津子)”“毛囊干细胞的起源和诱导机制的阐明(研究代表者:森田梨津子)”，该基础研究( c ) “有助于向毛囊干细胞进行lineage priming的基因网络的鉴定(研究代表者:森田梨津子)”、 理研BDR-大冢制药合作中心RBOC 2019年度公开募集计划“桥梁”“有助于向毛囊干细胞进行lineage priming的基因网络的鉴定(研究代表者:森田梨津子)”、 第13届资生堂女研究者科学格兰特“对毛囊上皮干细胞的lineage priming有贡献的细胞间相互作用的理解(研究代表者:森田梨津子)”、 是在科学技术振兴机构( JST )战略性创造研究推进事业CREST“综合1细胞分析的创新技术基础(研究总结:菅野纯夫)”领域的研究课题“内脏器官·组织内未知细胞的命运功能的1细胞混合同时测量(研究代表者:二阶堂爱)”的支持下进行的。原論文情報 森田日清子、三曾纪子、佐佐木弘子、林田哲子、梅田美嘉、山本孝夫、柴田Tatsuo、阿部孝夫、木永成、古田靖子、二阶俊博和藤原，“追踪毛囊干细胞的起源”，《自然》，10.1038/s41586-021-03638-5在新标签页中打开发表者 物理化学研究所 生命功能科学研究中心细胞外环境研究小组 研究员森田梨津子 队长藤原裕展
