科研 | Nature Medicine：工程化细菌诱导持久的肿瘤消退和全身抗肿瘤免疫应答
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合成生物学通过对活细胞进行遗传编辑，正在推动生物医学进入一个崭新的时代。该突破性的方法促进了能智能地感知和响应各种环境的工程化系统的创建，可最终增加治疗的特异性和有效性，并显著超出了基于分子疗法的治疗功效。其中，将细菌作为治疗传递系统以便在体内选择性地释放治疗相关的有效载荷是上述方法的典型代表。在本文中，研究者设计了一种可以在肿瘤微环境中靶向裂解并释放CD47（CD47nb，一种可编码的纳米抗体）的非致病性大肠杆菌菌株（non-pathogenic Escherichia coli strain）。CD47nb作为一种抗吞噬细胞受体，通常在多种人类癌症中过表达。研究者发现，通过肿瘤定植细菌靶向释放CD47nb，可促进肿瘤浸润性T细胞的活化，刺激肿瘤快速消退并抑制转移，从而延长荷瘤小鼠的生存期。此外，局部注射CD47nb表达菌株还可以刺激荷瘤小鼠全身抗原特异性的抗肿瘤免疫应答，从而抑制对侧未处理肿瘤的生长，该方法为工程细菌用于免疫治疗引起的局部效应提供了概念验证。因此，工程菌有望成为安全、局部免疫治疗的有效载荷传递载体，进而诱导系统性的抗肿瘤免疫应答。
论文ID
原名：Programmable bacteria induce durable tumor regression and systemic antitumor immunity
译名：基于工程化细菌诱导持久的肿瘤消退和全身抗肿瘤免疫应答
期刊：Nature Medicine
IF：32.621
发表时间：2019
通信作者：Nicholas Arpaia 、Tal Danino
通信作者单位：美国纽约州哥伦比亚大学生物医学工程系、纽约哥伦比亚大学赫伯特欧文综合癌症中心
实验设计
在本研究中，研究者通过对一种非致病性大肠杆菌菌株（non-pathogenic Escherichia coli strain）进行工程化修饰，使其可以在肿瘤微环境中靶向裂解并释放CD47（CD47nb，一种可编码的纳米抗体），同时可在实体瘤中定殖，且能够有效抑制远端未注射部位的肿瘤增长。与传统治疗手段相比，并未见明显的毒副作用。在研究中，研究者将合成生物学手段对细菌进行工程化修饰，使其能够在肿瘤微环境中生长并增殖，当菌体的数量达到临界值时，非致病性的大肠杆菌就会进行编程产生自我杀伤，裂解后能释放CD47nb，继而引发肿瘤局部的抗肿瘤免疫应答。此外，在部分菌体会通过裂解存活下来之后，可以重新开始生长繁殖，该过程可以实现在治疗中进行多次药物输送，进而实现较好的肿瘤控制作用。
结果
1 通过编码同步裂解回路的免疫治疗工程菌诱导功能性靶向CD47纳米抗体的释放
研究者设计了一株包含同步裂解回路(synchronized lysis circuit, eSLC) 的大肠杆菌菌株，该菌株可以在肿瘤组织内定植，并在肿瘤内聚集裂解，以局部释放编码的纳米抗体CD47 (eSLC - cd47 nb) (图1A)，该载药系统结合了局部免疫治疗药物和免疫共刺激的细菌裂解物佐剂，以激发抗肿瘤免疫应答，从而促进局部肿瘤的消退。表达eSLC-CD47 nb的大肠杆菌(eSLC-CD47nb-expressing E. coli) 在OD600中表现出多次周期性的下降趋势，显示出多级的同步裂解，而未表达SLC− E. coli的大肠杆菌则表现出正常的细菌生长动力学(图1B)。同时，与基线相比，eSLC-CD47nb裂解液处理可使巨噬细胞的吞噬率增加90%，这表明eSLC-CD47nb可以显著增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，该作用通过剂量依赖性的阻断CD47以及和TLR激动剂的联合作用(图1D)。
图1 通过编码同步裂解回路的免疫治疗工程菌诱导功能性靶向CD47纳米抗体的释放。A. 携带编码同步裂解回路的大肠杆菌达到一定数量时，可诱导噬菌体裂解蛋白ϕX174E，导致细菌溶解并释放靶向CD47的纳米抗体，从而与肿瘤细胞表面表达的CD47相结合；B. 批处理液体培养中SLC+ 和SLC-型大肠杆菌随时间的生长动力学曲线，图中数据代表三个独立的实验重复；C. A20细胞与固定浓度的FITC偶联的CD47单克隆抗体 (FITC miap301) 共孵育，并连续稀释含有组成表达CD47nb (pSC02) 或空载体的细菌裂解液(pSC03)；D.用BMDMs检测预处理PBS或SLC+或SLC+ CD47nb+细菌裂解物的Dil标记的A20细胞的体外吞噬作用。
2 eSLC在局部肿瘤内产生CD47纳米抗体可激发抗肿瘤免疫应答
接下来，研究者在多个同系小鼠肿瘤模型中来评估eSLC-CD47nb的治疗效果。在BALB/c小鼠双侧均种植A20肿瘤，分别瘤内注射 PBS、eSLC菌或eSLC-CD47nb菌。结果发现，注射eSLC-CD47nb可在治疗后约10天内快速、持久地清除A20肿瘤(图2A)。同时，与接受瘤内注射PBS或eSLC对照菌的小鼠相比，经过eSLC-CD47nb处理的小鼠在治疗后30天中很少观察到肝转移(图2B)。值得注意的是，经eSLC-CD47nb处理的小鼠中，约有80% 可存活90天以上(图2C)，存活的小鼠经皮下注射10×106 A20细胞后，对再次攻毒具有抵抗能力 (图2D)，而首次接受试验的小鼠在接受相同批次A20细胞的注射后一周内即可观察到有肿瘤出现。接下来，研究者通过腹腔注射miap301和瘤内注射eSLC来评估CD47的阻断效果。与单独使用eSLC治疗相比，两组均无明显差异。虽然重组CD47nb或超声处理的eSLC-CD47nb细菌裂解物与eSLC处理的小鼠相比，肿瘤生长较慢，但只有在eSLC-CD47nb表达菌株处理后肿瘤才可以完全消退(图2E)。上述结果表明，由SLC介导的肿瘤内持续释放CD47nb对治疗效果是至关重要的。
接下来，研究者为了评估该方法是否具有更广泛的适用性，研究者通过静脉注射和使用其他类型的小鼠肿瘤模型来评估其治疗效果。结果发现，在其他同系的小鼠皮下瘤模型中瘤内注射eSLC-CD47nb时的情况，例如在乳腺癌细胞(4T1，图2F)和黑色素瘤细胞(B16-F10，图2H)。在4T1模型中，注射eSLC-CD47nb的小鼠肺转移明显减少(图2G)。此外，研究者还评估了eSLC-CD47nb通过静脉给药靶向治疗肿瘤的安全性，结果发现，与系统注射CD 47抗体(miap301)的小鼠相比，静脉注射eSLC-CD47nb的小鼠肿瘤生长明显减慢(图2I)。综上所述，这些结果表明eSLC-CD47nb可以促进局部肿瘤的消退，同时也可以预防转移，提示系统性抗肿瘤免疫应答的诱导可能是由肿瘤特异性T细胞介导的。
图2 在多个同系小鼠肿瘤模型中，通过eSLC在瘤内产生CD47纳米抗体可引起抗肿瘤免疫应答。A. BALB / c小鼠在两侧后肢皮下植入5×106个A20 B细胞淋巴瘤细胞，肿瘤体积达到100-150 mm3时，在双侧肿瘤中，每3-4天分别用PBS，eSLC或eSLC-CD47nb进行瘤内注射；B. 细菌治疗后第30天对肝脏中存在的转移结节进行定量分析；C. A20荷瘤小鼠的Kaplan-Meier生存曲线；D. 在初始治疗后第90天，用10×106个A20细胞再次皮下种植在已完全清除A20肿瘤的小鼠，首次接受试验的小鼠在皮下每侧接种5×106个A20细胞；E. 当A20肿瘤体积达到100-150 mm3时，小鼠接受瘤内注射（i.t.）eSLC，eSLC-CD47nb细菌裂解液，rCD47nb或eSLC-CD47nb，或单独腹腔注射（i.p.）CD47单克隆抗体或与肿瘤内eSLC联合，每3-4天注射一次，共进行4次；F. 肿瘤生长曲线，将BALB / c小鼠皮下植入106个4T1-荧光素酶标记的乳腺癌细胞；G. 4T1-荧光素酶标记的小鼠皮下瘤的肺组织体内成像和经eSLC或eSLC-CD47nb治疗的小鼠肺部转移灶数量的定量分析；H. C57BL / 6小鼠皮下种植B16-F10黑色素瘤（5 × 105）的肿瘤生长曲线；I. BALB / c小鼠后肢两侧注射5×106个A20细胞的肿瘤生长曲线。
3 eSLC-CD47nb的免疫治疗型工程菌诱导适应性抗肿瘤免疫应答
研究表明，体外脂多糖暴露会导致巨噬细胞SIRPα的下调。基于此，研究者假设细菌裂解佐剂和CD47阻断SIRPα下游信号的联合使用，可以降低SIRPα在肿瘤相关巨噬细胞表面的表达。此外，在经过eSLC-CD47nb治疗之后的免疫表型显示，与经过eSLC细菌治疗的荷瘤小鼠相比，FOXP3-CD4 +和CD8+ T细胞的增殖均有所增加(图3A, B)。此外，经eSLC-CD47nb处理过的肿瘤，其肿瘤浸润的FOXP3-CD4 +T细胞在PMA和离子霉素的体外刺激下，可以分泌更高水平的IFN-γ (图3 C)。同时，还发现肿瘤组织内部granzyme B+CD8+ T细胞以及其他适应性免疫激活相关的细胞比例显著升高(图3D)。上述结果表明，eSLC-CD47nb不仅可以诱导肿瘤内T细胞的活化和增殖，还可以进一步诱导全身抗A20的记忆T细胞反应。
图3携带eSLC CD47nb的免疫治疗型工程菌可诱导较强的适应性抗肿瘤免疫应答。首先，在BALB/c小鼠后肢双侧种植5×106个A20细胞，当肿瘤体积达到100-150 mm3 (第0天)时，分别在第0、4和7天用PBS、eSLC或eSLC CD47nb处理小鼠。第8天分离皮下瘤组织，匀浆，从中分离出肿瘤浸润的淋巴细胞进行流式分析。A. PBS (n= 8)、eSLC (n= 8) 或eSLC CD47nb (n= 7) 处理组小鼠肿瘤内分离的Ki-67+FOXP3- CD4+和CD8+ T细胞的比例；B. PBS (n= 8)、eSLC (n= 8)或eSLC CD47nb (n= 7) 处理组小鼠肿瘤内分离的Ki-67+CD8+ T细胞的比例；C. 在体外经PMA和离子霉素（brefeldin A存在下）刺激肿瘤浸润淋巴细胞，分析IFN-γ+ FOXP3- CD4+T细胞比例；D. 肿瘤内GzmB+CD8+ T细胞百分比。
4 工程细菌治疗后的系统适应性免疫可间接抑制未处理部位肿瘤的生长
肿瘤的持久缓解不仅需要消除治疗后的肿瘤，还需要全身抗肿瘤免疫来清除远处转移病灶。基于此，研究者在观察到eSLC-CD47nb治疗可增强肿瘤浸润T细胞对治疗肿瘤的效应作用的基础上，进一步评估了eSLC-CD47nb治疗是否可以延缓未治疗部位肿瘤的生长。研究者采用单侧eSLC-CD47nb治疗小鼠皮下种植的双侧A20肿瘤(图4A)。对照组eSLC菌注射并未对未治疗部位的肿瘤生长有影响，而经过eSLC - cd47nb对原发肿瘤的注射，可以显著减缓对侧未治疗部位肿瘤的生长(图4B, C)。为了进一步量化这种效应，研究者通过计算每只小鼠肿瘤体积变化曲线的斜率，计算了治疗组与未治疗组肿瘤的平均生长速率(mm3/天) (图4D)。上述结果表明，与对照组相比，eSLC-CD47nb处理组的小鼠原发注射部位及未处理部位的肿瘤均有较低的增长趋势。流式分析未处理部位小鼠肿瘤浸润的淋巴细胞，其中原发肿瘤在注射eSLC-CD47nb后，CD8+ T细胞活化和增殖比例增加(图4E)，同时 FOXP3-CD4 + T细胞增殖比例也有所增加。经A20-Id肽体外刺激之后，研究者发现与eSLC或PBS处理组相比，eSLC-CD47nb治疗组小鼠肿瘤浸润的IFN-γ+ CD8 + T细胞比例显著增高(图4F)。均质化肿瘤组织及肝脏和脾脏组织的涂片显示，细菌生长仍然可以定植于治疗后的肿瘤组织，未治疗的肿瘤组织或肝脏及脾脏的细菌培养均未超过检测限(约1×103 CFU) (图4G)。此外，由SLC介导的CD47nb释放似乎是诱导强有力的远端抗肿瘤免疫应答效应的必要条件。尽管与eSLC相比，eCD47nb(一种表达CD47nb的SLC菌株)的使用减缓了治疗后病灶的生长，但是与eSLC-CD47nb相比，其对未治疗肿瘤的影响要弱得多（图4I）。综上所述，上述结果表明，工程化的菌体裂解载体系统可以产生有效的、肿瘤特异性的适应性免疫反应来系统地清除远端的肿瘤病灶。
图4细菌治疗后的系统适应性免疫抑制未治疗肿瘤的生长。A. BALB/c小鼠(每组4只)在双侧皮下种植5×106个A20细胞，当肿瘤体积达到100-150 mm3时，每3 ~ 4天进行瘤内注射PBS、eSLC或eSLC CD47至单侧肿瘤；B, C. 治疗组与未治疗组的肿瘤生长曲线；D. 治疗组与未治疗组肿瘤的肿瘤生长速率(mm3 / d ) ; E. 未治疗的肿瘤在单侧注射细菌后第8天分离瘤内Ki-67+CD8+ T细胞比例; F.体外刺激肿瘤浸润淋巴细胞与A20-Id肽(DYWGQGTEL)共处理，分析IFN-γ+ CD8+T细胞比例；G. SLC+大肠杆菌在瘤内注射后第3天、第6天和第30天的组织分布；H, I, 每3-4天共4次单侧瘤内注射eSLC、eCD47nb或eSLC - cd47nb，治疗组和未治疗组A20肿瘤生长曲线
结论
这种方法结合了工程化细菌裂解产物固有的免疫刺激特性和纳米抗体介导的对吞噬受体的阻断作用，该治疗策略可以促进肿瘤浸润淋巴细胞的增殖和活化，从而诱导持久的系统性抗肿瘤免疫应答。上述研究结果表明，与传统的系统性单克隆抗体治疗相比，肿瘤局部靶向裂解介导的CD47纳米抗体释放具有多种优势：肿瘤内通过eSLC递送纳米抗体可提高局部免疫治疗药物有效浓度，同时可以预防系统性毒副作用。局部使用eSLC-CD47nb治疗可诱导系统性抗肿瘤免疫应答，而CD47单克隆抗体治疗后并未观察到类似免疫反应。工程菌易于表达附加的免疫治疗纳米抗体或细胞因子，这为评估其他几种免疫疗法的组合提供了可能，而其他几种免疫疗法的组合逐渐显示出了系统性毒性，但在本研究中，使用eSLC进行肿瘤内递送时是安全有效的，未观察到明显的毒副作用。
评论
多项研究表明，由于肿瘤免疫微环境的特殊性，细菌在肿瘤微环境内可以优先生长，并通过免疫系统的招募和激活对肿瘤生长产生局部影响。随着合成生物学的不断发展，研究者认为工程细菌可控释放重组免疫疗法可以使肿瘤局部聚集更高更有效的药物治疗浓度，同时防止与系统性治疗后出现的类似毒副反应。近来的研究强调了抗原呈递细胞在肿瘤免疫微环境中的重要性，并指出效应T细胞在抗CD47介导的临床反应中是不可或缺的。在该研究中，细菌裂解引起的局部炎症，加上CD47对肿瘤细胞的局部阻断，会增加肿瘤细胞的吞噬作用和肿瘤相关抗原的表达，从而增强抗肿瘤T细胞的免疫应答。该载药系统允许以时空限定的方式进行免疫治疗，并可以在多种实体肿瘤微环境中进行免疫治疗。此外，由于观察到的局部抗肿瘤免疫应答，该研究提供了一个未来的肿瘤治疗策略，即通过原位注射入可接近的部位从而治疗原发肿瘤的远端转移病灶。
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