编译：傻狍子，编辑：小菌菌、江舜尧。
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导读
在典型的厌氧消化（AD）系统中，底物降解产生的代谢阻碍了微生物功能的确立。因此，经过数十年的经验，由有机化合物产生的复杂的产甲烷过程仍然是一个谜。在这项研究中，获得了简化的AD微生物群落、底物、连续的反应器等操作。遵循以基因组为中心的宏基因组学方法，全面研究AD的代谢途径和微生物协同网络。从特定产甲烷中获得的8个元基因组组装了63个元基因组组装基因组（MAG）。在实验条件下，从注释的基因及其动态性重建了代谢途径。
结果表明：
① 产甲烷能够增加了独特的新陈代谢，并提出了一种新的无乙酸盐形成的葡萄糖矿化模型，该模型在Clostridiaceae和Methanoculleus thermophilus存在。
② 此外，分解代谢途径在未表征的共营养乙酸氧化剂Synergistaceae中阐明。
总之，单个微生物的功能作用紧密依赖于分解代谢途径。以基因组为中心的宏基因组学成功构建了以前未分离的微生物基因组，并阐明了目前AD过程所不具备的代谢途径。
这项研究为揭示AD微生物生态学提供了新的观点，并建议应更多地关注AD微生物群落中特有的未表征的代谢。
原名：Novel ecological insights and functional roles during anaerobic digestion of saccharides unveiled by genome-centric metagenomics
译名：宏基因组学研究揭示了糖厌氧消化过程中的功能作用
期刊：Water Research
IF：7.913
发表时间：2018.12
通讯作者：Panagiotis G. Kougias
本研究中分析的微生物群落是从连续进料的实验室规模产甲烷反应器中获得的。采用足够的嗜热性AD的经验条件，即55℃作为工作温度和15天作为水力停留时间（HRT）。该反应器最初接种了来自Snertinge嗜热沼气厂（丹麦）的消化物（主要由粪肥经营）和有机食品废物，提供了可介导异质底物的所有AD步骤的微生物组。实验分为四个阶段，每个阶段所用的原料均是基础培养基，在生化降解步骤后逐步简化了有机化合物，即亲和酶（多糖），葡萄糖（单糖），VFA混合物（乙酸盐：丙酸盐：丁酸盐=2.6：1.1：3.8）和乙酸。用于糖质底物（亲和酶和葡萄糖）的有机负载量为1 g VS / L，依次将中间体减半，VFA为0.5 g VS / L，而醋酸为0.25 g VS / L每天。在消化过程中评估总糖浓度、甲烷产量、VFA浓度以及pH值。采用液相色谱测量未定量的糖，采用水置换式煤气表定量沼气产量，并使用配备有热导检测器气相色谱仪测量甲烷浓度及VFA和乙醇浓度等其他消化产物。采用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，利用Illumina进行宏基因组测序。
1 反应堆性能
从连续搅拌氏反应器中获取宏基因组，该反应器中装有一系列特定的底物，即亲和酶，葡萄糖，VFA混合物和乙酸。操作条件有利于反应器内甲烷生成微生物群落的发展。在实验过程中，甲烷是稳定的主要消化产物，同时还含有微量的VFA（乙酸和丙酸）（表1）。在整个实验过程中未检测到具有三个以上碳原子和乙醇产物的VFA。众所周知，VFA是厌氧消化过程中的中间产物，因此，VFA的低水平检测表明反应器运行情况良好。反应器的pH值保持在6.7至8.2之间，这是甲烷生成的最佳范围的值。在向反应器中加入含VFA混合物的底物期间内记录到最高pH值，这可能是由于在此条件下二氧化碳的量比较低导致的。
表1 亲和酶，葡萄糖，VFA混合物和乙酸消化过程中的产量、pH值
2 MAGs重建
用基因组为中心的宏基因组学方法解剖AD微生物组。高通量测序数据经过过滤，组合和分类，并采用“分层聚类，然后进行冠层轮廓选择”方法，总共产生63个MAGs。本研究着重于较高丰度的微生物，包括21种高质量MAGs（完整性高于70％，污染低于10％），12种中低质量MAGs（完整性低于70％且低于10％）污染）和两个“元MAGs”（污染高于80％）。所选择的MAGs在分类学上分为四个细菌门和一个古细菌门，即Firmicutes，Synergistetes，Chloroflexi，Bacteroidetes和Euryarchaeota（图1）。这些微生物在嗜热过程中起着重要作用。具有特定底物的反应器的连续操作对微生物存活率施加了特定且恒定的选择压力。实验条件通过洗掉不支持微生物生长的底物来简化微生物群落。结果突出显示了特殊的群落组成，特别用于亲和酶，葡萄糖，VFA混合物和乙酸降解的微生物。由于根据AD步骤逐步简化了底物，因此可以通过在特定水解底物存在/不存在条件下来推断每个MAGs的代谢作用（图1）。对MAGs的覆盖范围进行分层聚类分析，结果表明31种细菌可通过分解代谢特性将MAGs分为4类：所有被选择的细菌MAG组都是整个群落的代表，因为它们与相应的古菌群落相结合，在每个实验期间占整个微生物群落的90%以上。因此，我们提出，这些MAG组独立地包含了帮助产甲烷菌从所选择的底物完成生物甲烷化过程的整套基因。关于高质量的MAG，其代谢能力已通过途径得到进一步证实。我们检查了所有MAG的基因谱并选择了92种酶来覆盖特定底物AD代谢反应（图2）。水解步骤仅在亲和酶降解期间有效，并且主要由细胞外酶介导。接下来的产酸步骤由G1和G2通过Embden-Meyerhof-Parnas（EMP）途径进行。但是，大多数丙酸和丁酸生物合成的大多数关键基因缺失，表明这些化合物在充分的亲和酶和葡萄糖降解过程中没有形成。表明根据底物的特性，可以通过多种途径进行产乙酸。更具体地说，丙酮酸的乙酰化主要发生在G1和G2，这是由丙酮酸铁氧还蛋白驱动的氧化还原酶基因的存在所表明的。此外，G3中分别通过甲基丙二酸辅酶α途径和β-氧化途径记录了产乙酸。产甲烷作用是通过四个具有不同代谢特性的古细菌MAGs进行的，这些代谢特性可以改变对应的细菌群落。实验还使用了乙酸同养型乙酸（SAO）/同型产乙酸基因（包括传统的Wood-Ljungdahl（WL）途径以及通过甘氨酸裂解系统和四氢叶酸途径的新型途径）检查了直接产甲烷底物，即乙酸盐和CO2 / H2的相互转化。
图1 涵盖35个MAG，属性和分类学。左侧是热图，显示了8个基因组中35个MAGs的平均覆盖率。颜色和覆盖率之间的对应关系在每个面板的顶部报告。使用基于Pearson相关度量的分层聚类，可以将细菌MAGs分为四类：G1，亲和酶降解细菌群落；G2，葡萄糖降解细菌群落；G3，VFA降解细菌群落，G4，乙酸盐降解细菌群落。右侧列出了MAGs的基本属性（基因组大小，完整性和污染性），并以粗体突出显示了高质量MAG。
图2 MAGs中公认的整合分解代谢途径。初始底物和最终产品以红色突出显示，而中间体以黑色报告。 CoA，辅酶A，THMPT，四氢甲基蝶呤。两种化合物之间的彩色箭头表示用于生物转化的一系列代谢反应。右下角报告了颜色与相关底物分解代谢之间的对应关系。MAG介导的特定转化过程用六个不同的框表示：黄色，G1社区。蓝色，G2社区。紫色，G3社区。橙色，G4社区。带有氢营养型产甲烷基因的红色古生MAG。绿色，古细菌MAGs含有破乳产甲烷菌基因。
3 亲和酶降解微生物群落
G1由9种分布极不均匀细菌MAGs组成。DTU0444相对丰度为53%，主导了微生物群落，其次是DTU0497（14％）。在9种MAGs中，有7种，包括DTU0444和DTU0497，被归类为Firmicutes菌门，已经证明其成员在嗜热性纤维素分解过程中通过产生多种纤维素分解酶（即纤维素酶）而发生降解作用。但是，与以前的发现相反，DTU0444和DTU0497均未编码参与纤维素小体形成的蛋白质。尽管有些MAGs含有多种纤维素分解基因，但所有Firmicutes spp 在G1中共有编码特定内切葡聚糖酶的基因，表明该酶对于嗜热性AD过程中微晶纤维素的水解至关重要。G1的其余两个MAGs分别是DTU0435和DTU0433，分别属于Chloroflexi 和Rikenellaceae，并且与Firmicutes spp相比，它们包含编码碳水化合物结合域的独特基因图谱。如图1所示，亲和酶降解过程中古细菌群落的相对丰度极低，这表明产甲烷菌的细胞产率比水解细菌低得多。细胞产量的差异可能归因于底物利用期间释放的能量。更具体地说，通过DTU0444中β-糖苷键的磷酸化裂解获得的高ATP促进了其在微生物群落中的优势。另一方面，产甲烷古菌中的电子传递磷酸化为细胞生长提供了有限的能量，导致其丰度较低。DTU0440被确定为强制性氢营养型产甲烷菌嗜热甲烷菌，是最丰富的古细菌，表明在亲和酶降解过程中发生了氢营养型产甲烷菌。在降解过程中还存在被鉴定为嗜热甲烷菌的DTU0439，但其丰度较低。甲烷菌属已经提出是混合营养的，但主要是乙酰碎裂的产甲烷菌。相似地，M. thermophila表明在没有甲醇的情况下由CO2 /H2产生甲烷的活性，较弱。此外，M. thermophila，被称为具有细胞色素的产甲烷菌，在自然环境中普遍存在的条件下，无法与不含细胞色素的产甲烷菌（DTU0440）竞争。因此，在当前研究中，M. thermophila的功能作用被确定为乙酰破伤性产甲烷菌。
4 葡萄糖降解微生物群落
在葡萄糖降解过程中，整个G1的相对丰度显着下降，五个代表性MAGs细菌群落转变为更专业的G2（图1）。最丰富的MAGs（DTU0446）属于Clostridiaceae，占细菌群落的36.5％，其次是Methanoculleus thermophilus，占33.0％。具有纤维素分解基因的MAGs被DTU0446竞争，DTU0446包含编码磷酸转移酶系统（PTS）的葡萄糖通透酶的遗传物质，可将葡萄糖从周质或细胞外空间转运至细胞质并磷酸化。该研究表明DTU0446的优势主要是低丰度的微生物群落利用PTS在基于粪便的沼气反应堆中运输糖分。这可能是PTS有利于运输天然底物（例如牲畜粪便）中不丰富的细胞外游离葡萄糖，而多糖水解产物可能采用了另一种底物吸收机制。G2 中MAGs均未编码完整的WL途径，也未存在于乙酸盐降解群落（G4）中，表明与产甲烷菌合作具有一周的SAO能力。此外，Methanoculleus thermophilus是利用产甲烷菌的强制性H2，是葡萄糖降解过程中唯一富含古菌的MAGs，表明大部分甲烷是通过氢营养途径产生的。SAO和乙酰碎裂的甲烷生成均不存在，表明乙酸盐不是葡萄糖分解代谢过程中必需的中间产物。因此，我们提出了一种新的葡萄糖降解模型，该模型结合了EMP糖酵解和通过甘氨酸裂解系统和四氢叶酸途径的丙酮酸氧化。可以基于葡萄糖降解社区中两个最丰富的微生物（DTU0446和DTU0440）的基因含量来建立该模型（图3）。具体而言，在DTU0446中，葡萄糖首先通过EMP降解为丙酮酸，然后通过甘氨酸裂解系统和四氢叶酸途径降解为CO2。此外，在DTU0446中发现了红细菌固氮复合物（Rnf），利用反向质子动力产生还原的铁氧还蛋白，以H2的形式用于电子处理。DTU0440可将产生的CO2 / H2进一步用于甲烷生成。
图3 DTU0446和DTU0440中确定的专性同养型葡萄糖降解途径。葡萄糖首先由DTU0446通过磷酸转移酶系统（PTS）转运到细胞中，并被椭圆框中所示的氧化还原酶氧化。第一步是在Embden-Meyerhof-Parnas（EMP）途径中用甘油醛磷酸脱氢酶（GAPDH）氧化为丙酮酸。丙酮酸通过gcvP（甘氨酸脱氢酶），二氢脂酰脱氢酶（LDP），folD（亚甲基四氢叶酸脱氢酶-环水解酶）和节能的甲酸脱氢酶复合物（ECFdH）进一步氧化为CO2。释放的电子以H2的形式与红细菌固氮复合物（Rnf）和富电子加氢酶复合物（EChyd）一起放置。CO2和H2转移至DTU0440，并通过fwd（甲酰甲基呋喃脱氢酶），亚甲基-H4MPT脱氢酶（Mtd，Mer）和甲基-CoM还原酶（Mcr）代谢为CH4。提取用于氧化还原反应的电子通过还原F420的加氢酶（Frh），F420非还原的加氢酶（Mvh）和杂二硫键还原酶（Hdr）从H2中提取。Foc（甲酸酯转运蛋白）和Fdh（甲酸酯脱氢酶）可以支持甲酸在种间电子转移中的利用。在两个用于ATP合成的MAG中都发现了V型三磷酸腺苷合酶（ATPase）。反应物和副产物包括氧化/还原的铁氧还蛋白（Fdox和Fdred），脂蛋白（LP），四氢叶酸（THF），氧化/还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADP和NADH），甲呋喃（MFR），四氢甲蝶呤（THMPTH）和氧化/还原的辅酶F420（F420 / F420H2）。
5 VFA适应性微生物群落
VFA降解者在发酵过程中AD微生物群落关于移除中间产物中起关键作用。在第三个实验期间，M. thermophilus（DTU0440）和M.thermophila（DTU0439）的相对丰度分别为19.4％和6.3％。除DTU0445以外，所有G3成员在亲和酶和葡萄糖降解周期的相对丰度都非常低。该观察结果与先前的研究一致，后者表明乳酸，丁酸和甲酸不参与葡萄糖降解，而丙酸降解剂占总体的比例不到2％。不幸的是，由于基因组的高度污染，DTU0445被确定为几种生物的集群。葡萄糖和VFA分解代谢的基因都存在于该元基因组中，并且可能源自G2和G3中具有较高相对丰度的细菌簇。除DTU0445外，其他MAGs均匀分布，相对丰度范围从2.9％到7.2％（图1）。三个MAGs（DTU0451、DTU0456和DTU0457）属于一种利用家族的羧酸，高质量的基因组（DTU0451）包含用于丁酸酯降解的完整基因。相反，G3中的DTU0485，DTU0493和DTU0495包含负责丙酸降解的基因，这与以前报道一致（Peptococcaceae, Synergistaceae 和 Firmicutes）的分解代谢能力相符合。在标准条件下，丁酸酯和丙酸酯的降解都是热力学上的正电子过程，需要与氢营养型产甲烷菌（M. thermophiles）专性菌耦合，这降低了产物（主要是H2）的浓度，从而降低了实际反应器条件下的自由能变化。乙酸既起源于流入反应器，又在乙酸生成过程中产生，它促进了甲烷化作用，从而导致M. thermophile（DTU0439）。此外，一些MAGs包含与SAO /同型乙酰化相关的基因，因此产甲烷途径从乙酰转变为氢营养型，反之亦然。具体而言，DTU0455和DTU0493包含完整的基因集，可通过甘氨酸裂解系统和四氢叶酸途径编码拟议的SAO途径。此外，DTU0445中还存在乙酰辅酶A合酶/ CO脱氢酶。
6 乙酸适应性微生物群落变化
与以前的实验时期相比，观察到M. thermophila进一步增加，表明甲烷生成途径增强。然而，乙酸盐代谢细菌（G4）占总微生物群落的70.1％，表明乙酸盐转化为H2 / CO2提供了最终产甲烷作用是通过氢营养路径的证据。G4由先前鉴定的SAO细菌组成，其中六个属于Firmicutes，两个MAGs属于 Synergistaceae，一个MAG属于Bacteroidetes。最丰富的分类单元是Synergistaceae spp，其中代表性MAGs（DTU0491和DTU0492，）分别占微生物总数的17.9%和8.5%。该分类单元的高丰度表明，在产甲烷环境下，SAO发挥了作用，这一结果与基于稳定同位素的功能研究一致。然而，大多数协同菌分离物仅在功能上与氨基酸发酵有关，而从基因组的角度从未探讨过乙酸盐的氧化能力。奇怪的是，DTU0491和DTU0492均缺少乙酰辅酶A合酶/ CO脱氢酶的基因，这表明它们不太可能通过WL途径进行SAO。考虑到DTU0491（1.43 Mb）的大小小于所报告的分离株，并且已完成75％，我们还研究了其他公共可获得的Synergistetes基因组的基因含量。尤其是，对基因组在线数据库（GOLD）数据库中的27个公共可用的协同体基因组进行了研究，以判定SAO途径。结果表明，DTU0491中缺少的EC 2.1.2.10通常存在于Synergistetes spp中。DTU0491中不存在它可能是因为在组装过程中未将其恢复。此外，分析的基因组均未包含乙酰辅酶A合酶/ CO脱氢酶的基因，但在29个测试的基因组中，有20个包含完整的基因集（少于两个区块）可以执行类似Thermotogae的SAO。为了节省能源，DTU0491中不存在SAO细菌常用的rnf和离子转运铁氧还蛋白（ifo）。取而代之的是，我们发现了编码协同特定F420还原氢酶亚基的基因，这暗示了辅酶F420可用作电子载体来驱动氧化还原反应并直接以H2形式释放电子的可能性。
在亲和酶，葡萄糖，VFA混合物和乙酸盐降解过程中不同的群落组成表明，AD群落由仅在特定生态位中增殖。G1和G2之间的巨大变化与先前的研究有关，据报道，葡萄糖和淀粉在消化池之间的微生物群落组成存在显着差异。因此，这些结果表明，尽管水解是细胞外过程，但是底物的聚合度和分子结构可能对发酵菌施加选择压力，这可能是由于它们的底物摄取系统不同所致。这可能是AD预处理技术改变整体微生物群落组成而不是仅影响水解细菌的众多原因之一。
长期以来，产甲烷位在微生物之间形成专一的协同网络，以推动反应接近热力学平衡，例如VFA混合物和乙醇降解。但是，人们忽略了协同作用还可能使细菌从可发酵的底物（例如葡萄糖）中形成能量上不利的消化产物。在未鉴定的Firmicutes sp中提出了一种新的葡萄糖降解途径，（DTU0446）是葡萄糖降解过程中的主要细菌。在该途径中，常规的PFOR驱动的丙酮酸氧化被具有WL途径的甲基分支的甘氨酸裂解系统所取代，从而避免了在热力学上不利的乙酸盐氧化。该表明产甲烷途径是通过与具有与栽培菌株的代谢能力不同的代谢能力的细菌的协同关系而发生的。众所周知，AD社区是大量未培养的微生物，因此，在这个微观世界中，更专业的途径还没有被探索。产甲烷菌可以改变其主要的营养基团，以清除细菌产生的各种分解代谢产物。除了乙破和氢营养型产甲烷菌的二分分裂，我们还记录了Methanothermobacter 和 Methanoculleus spp之间的动态过渡。已观察到这种变化是对VFA浓度的响应，并且在长期运行中添加了外部氢气，归因于氢分压。比较两个氢营养型MAGs的基因谱，我们发现几乎相同的基因集介导产甲烷作用，但促进系统不同。另外，表明，M. thermophilus的鞭毛结构基因和multisubunit中的多亚基Na + / H +反转运蛋白基因，这表明利用质子原动力进行ATP合成的不同策略。先前已证明，具有较低ATP增益的产甲烷菌具有较低的H2阈值，从而提高了它们利用稀缺氢和其他电子供体（例如甲酸盐或CO）的能力。因此，除了营养特化外，具有不同代谢特性的古生菌物种的平衡还可以通过其能量耦合策略来调节。另一个有趣的观察结果是，该研究中的古细菌MAGs普遍缺乏生物合成甲烷生成所需的一些重要辅因子的基因，这表明可能存在基因同源物或未表征的生物合成途径，从而阻碍了代谢潜力的合成。
此外，该结果强调了SAO细菌在乙酸甲烷生成过程中的重要性。通过控制种间电子库的大小以及H2，甲酸，CO和铁离子等不同载体之间的分布，细菌群落的节能策略发挥了重要作用。众所周知，由于缺乏氧气作为有效的电子受体，AD具有有限的能量，在此类系统中实现负电子转移的关键是利用高能电子载体。我们发现了基因证据，表明在厌氧细菌中，铁氧还蛋白可用于接收来自两个来源的电子：
1）从底物上驱动能量上不利于一般电子载体的氧化还原反应，即NADP和
2）低能量电子载体通过离子氧化还原酶或电子富集酶。
此外，大多数细菌MAGs中也存在编码蛋白质的基因，该基因能够以H2的形式从还原的载体中释放电子。值得一提的是，除铁氧还蛋白外，辅酶F420氢化酶亚基也存在多个拷贝。辅酶F420的合成最近发现于多种细菌类群中，除了甲烷生成外，还可能在更广泛的微生物代谢中起作用。这项研究的结果可能会提出以下假设：辅酶F420可以介导AD系统中的有机化合物矿化。
长期以来，连续的4步经验概念已被描述为描述AD过程的方法，大多数关于AD微生物组的研究都含蓄地假设认为单个微生物在其中一个步骤是专门的。然而，本研究中发现的个体基因组不能按照AD步骤进行生理学上的定义，因为整个过程并不总是遵循4步结构。因此，可以得出结论，如果不阐明其代谢途径，就无法严格确定微生物的功能作用。目前研究表明，产甲烷生态位可以强制性突触代谢，这在未经培养的AD微生物中是独特的。在未来的研究中，应将原位生态基因组学应用于探索目前分解代谢知识之外的途径。强调的是，AD微生物的协同网络基于分解代谢的互补性，但也需要电子转移平衡和整体能量守恒。微生物选择转移电子和收集能量的策略也是选择营养同伴的关键因素。尽管本文提出的途径和节能机制仍需要以培养为基础的方法和基因表达进行全面验证，但这项研究是揭示整体AD同养化的一步，为进一步研究提供了新的思路。本文通过宏基因组学揭示了糖厌氧消化过程中功能作用，通过糖消化过程中的微生物群落，代谢与微生物协同代谢网络，建立了代谢途径。本文通过产甲烷独特的代谢过程中提出了新的无乙酸盐形成的葡萄糖矿化模型，成功构建了以前未分离的微生物基因组，并阐明了目前消化过程所不具备的代谢途径。这项研究为揭示糖厌氧消化过程中微生物生态学提供了新的观点。
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