综述 | BioRxiv：昆虫取食重塑了原生叶片微生物组 / 开普饭

编译：碎碎念，编辑：小菌菌、江舜尧。

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导读

在植物群落中昆虫取食无处不在，但是在自然系统中它们对植物微生物群落的影响还未被研究。通过对细菌序列为基础的计算来测定绝对细菌装载量，发现绝大多数原始野荠菜的叶际微生物的扩增受到昆虫取食的影响。昆虫取食后微生物群落分析发现微生物群落组成的生态多样性降低，但是微生物群落的扩展方向仅仅是由定量绝对丰度所决定的。拒食防御试验表明假单胞菌属和植物病原菌丁香假单胞菌重塑了植物的适应性。取食胁迫阻止了植物的繁殖，这与植物病原菌紧密相关。昆虫取食通过改变植物细菌在遗传和空间范围内的变化，从而驱动了植物病原细菌的流行以及植物原始微生物组的变化。本研究着重强调在生态系统中寄主和其他有机生命体之间的“非局部”生物交互作用是寄主相关微生物组群落组成的关键驱动因子。

论文ID

原名：Insect herbivory reshapes a native leaf microbiome

译名：昆虫取食重塑了原生叶片微生物组

期刊：BioRxiv

发表时间：2019.9

通讯作者：Parris T Humphrey

作者单位：哈佛大学

实验设计

1.田间试验对昆虫取食野荠菜行为对植物叶片内生微生物群落的影响进行研究，并在植株生长后期对取食危害程度、挂果率进行统计。试验采用随机的方式采取两个试验点的植物叶片样本进行后续的微生物组研究。本实验采用完全随机试验设计，2012年在 Emerald Lake (EL)试验点进行试验，24个试验小区；2013年在North Pole Basin(NP)试验点进行试验，60个试验小区。每两个试验小区（patch）相邻从而减小土壤误差，每个试验小区种植16株Bittercress，野荠菜（碎米荠属植物，十字花科草本）。黑角（Scaptomyzanigrita）成年雌性蝇，使用其具齿的产卵剂在卵形苦瓜叶中产生的刺孔内产卵。孵化并完成后，幼虫S.nigrita在野荠菜叶内产生疮痂。可见下图：

2.叶片组织中细菌扩增序列的测定——即扩增子测序研究叶片内生微生物组分别从EL和NP 两个试验点各收集192份植物叶片组织（共计384份），表面消毒后进行植物内生菌DNA的提取，然后进行扩增子测序。特别值得注意的是，为了尽可能消除植物内叶绿体（chloroplast）和线粒体（mitochondria）16S序列带来的干扰，本实验在PCR扩增的Mix中加入了消化性核酸（peptic nucleic acid (PNA) PCR clamps）来植物扩增序列进行消除（该方法在测定植物样本时可采用，国内中科院遗传发育所白洋老师之前也曾发表过有关植物样本测微生物组的方法，相信大家都熟悉）。然后，使用DADA222进行纠错、修整、质量过滤，并合并通过错误阈值的定序配对末端测序读段。原始约4百万reads中约90%的reads符合DADA2 质量检测。然后将这些reads定义为精确的扩增子测序变异体（ampliconsequencing variants，ASV）。手动整理来自野荠菜叶绿体或线粒体的16S reads，并汇总到“宿主衍生”中，以与细菌衍生的16S进行比较。为了定量测定昆虫取食胁迫与定殖微生物丰度和多样性之间的相关性，需要在16Scounts和细菌装载量之间构建关系。因此对寄主植物组织中细菌ASVs丰度设计一个变量指标（γ），以此表示叶片组织中内生细菌的装载量。基于定义的变量γ，对不同处理中的bASVs水平与昆虫取食之间的关系进行建模。

3.田间野荠菜所收获种子于温室大棚进行试验。该试验旨在研究植物防御激素对上述试验中所得到的核心微生物丰度的影响。

假说提出

对大多数生物体而言，被多种天敌侵袭时不可避免的，并且通常会在单个寄主生命中不断的发生。期初的侵袭会改变寄主的表型，也会改变其将来对重复侵袭的适应性，通常会在更大的时空范围内产生级联效应。鉴于共侵染对寄主健康及其寄生物群体动态具有较大的影响，对共侵染的详细研究变得常见。但是很少有研究对多种寄主相关微生物群落（微生物群落）进行研究。相反，微生物群落的研究往往集中于非生物因素对寄主表型及与微生物群落多样性的影响。但对于植物在非微生物等其他生物环境中生存是如何影响植物微生物群落组成的群体生物学研究仍处于空白。

对于植物而言，理解微生物群落的结构和功能，无论是应用的目的（植物促生和病害防治）还是作为寄主-微生物共生体的模式系统而言，都具有巨大的利益。昆虫取食对植物本身和农业环境都具有严重的威胁。昆虫取食通过组织损伤和诱导植物防御效应改变了植物的表型，从而改变了植物对昆虫和微生物侵袭的耐受性。因此，影响昆虫取食寄主的因子将很可能影响寄主相关微生物的定殖和扩增。尽管昆虫取食和植物相关病原微生物对植物表型和适应性具有明显的影响，但是它们通常被认为是独立的。本研究在本地非禾本草本植物上，通过研究叶片定殖细菌的丰度和多样性形式是如何被昆虫取食所影响进行阐述，并对昆虫取食、病原细菌侵染和植物适应性三者之间的关系进行探索。

本研究首先使用标记基因测序（16S rRNA）结合成对的叶片培养来建立和验证基于测序结果来对宿主组织中绝对细菌载量进行估计（目的是为了测序中排除植物本身核算的影响）。通过对细菌装载量与细菌相对于寄主的测序单元（相对定量测定细菌测序单元）之间的关系进行阐明，从而使得16S标记基因序列能够揭示昆虫取食与否样本之间整个细菌分类单元的丰度变化。然后，我们评估了整个研究植物群体中每个小区微生物丰度与昆虫食草强度之间的共聚程度（相关性分析），并将微生物-昆虫取食的共聚集与果实结实（植物适应性的一个组成部分）相关联。同时，我们直接测定了来源于野荠菜的12种假单胞菌（Pseudomonas spp）分离菌株对诱导植物防御的敏感性变化。为此，在温室试验中，通过用外源植物防御激素茉莉酸（JA）预处理植物来模拟先前的昆虫取食，进一步对菌株进行研究。

本研究表明昆虫取食通过诱导植物防御响应来使得植物内部常见和潜在的植物病院细菌类群扩增，进而改变内生细菌多样性组成。该机制至少解释了在田间条件下，昆虫取食和叶片微生物群落中的内生细菌丰度呈显著的正相关。关键的是，本研究发现传统的高通量标记基因的组成分析无法揭示细菌丰度的变化形式和程度，而只能表示寄主细菌装载量的变化趋势。通过将标记基因单元与绝对标准进行关联，本研究表明昆虫取食与自然植物群落中植物叶片的细菌装载量变化相关。简单地说，本工作突出了以下工作的重要性：

1.解释宿主在自然环境中与其他定居者之间普遍但“非局部”的生物相互作用；

2.运用检测和分析方法来量化对微生物适应性组成的作用。

结果

1 在昆虫取食叶片组织中，细菌装载量增大

通过对16S counts 信息与绝对细菌丰度之间建立关联，发现在昆虫取食叶片中检测到的部分细菌是未取食叶片中所检测到细菌数量的两倍之多。然后在实际测得的数据中，通过平行观察进行验证，发现昆虫取食叶片较未取食叶片中细菌的装载量更高。

2 取食相关细菌扩增具有群体广泛性和种属特异性

利用扩增序列中高分类分辨率（taxonomic resolution）和抽样深度（sampling depth）来测定野荠菜叶片微生物组的中多种细菌的丰度和分布。与非取食叶片相比，取食叶片中来自于几个细菌家族的细菌扩增序列突变体的密度较高。对绝大多数细菌家族而言，其在取食植物中密度的增加在NP试验点大于在EL试验点。但是，这很大程度上是因为若干个属在NP位点未取食叶片中的加载量较EL位点更低。相反，对于大多数细菌的加载量在两个位点取食叶片中的加载量相同。Pseudomonadaceae（假单胞菌科）是所有叶片中丰度最高的分类群，在取食条件下呈现最大的成倍增加。

几个科水平上的γ模型显示了在截距和斜率值对bASV水平差异的支撑，包括假单胞菌科（Pseudomonadaceae）和鞘脂单胞菌科/鞘氨醇单胞菌科（Sphingomonadaceae）。两个独立的bASVs会特别驱动所有分类级别中科水平模式，其占两个地点所有序列reads的20%。在假单胞菌属中，假单胞菌3是丰度最大的bASV，属于植物致病性丁香假单胞菌进化枝。之前研究表明，丁香假单胞菌菌株作为病原菌会导致植株枯萎，减弱野荠菜叶片的光合作用。因此，在取食叶片中细菌装载量的增加信号的主要组成来源于丁香假单胞菌属中的植物致病性类型。

图1 昆虫取食叶片中内生细菌装载量普遍增加

3 取食条件下叶片微生物群落组成的变化

在一个组成框架对绝对细菌丰度模式进行分析，对取食和未取食叶片之间群体结构和生态多样性之间的差异进行检测。特别的，本研究发现在取食叶片中更低的均一度，更倾向于小数量的细菌类别，在取食叶片中假单胞菌组成了更加大的比例。这是由于其在未取食叶片中具有较高的平均丰度，在取食叶片中大量增加。科水平相关丰度在取食和非取食叶片样品的Shannon–Jensen divergence上有所不同。说明取食叶片上细菌的扩增能够在广泛的分类水平上减小植株内部的多样性，增加植株之间的多样性。

图2 受损的草食动物叶子组成的微生物群落组成分散，生态多样性降低，严重移向假单胞菌科

4 植物对昆虫取食的防御作用增强了植物中植物病原菌的增长

统计结果发现用植物防御激素JA进行的植物预处理会导致十二个假单胞菌属菌种中的五个菌种在宿主内部生长的明显变化。变化最为明显的是两个系统发育上不同的丁香假单胞菌分离株增加了2.5-5倍（Fig. 3a）。这两个菌株在寄主内密度的增加可以解释假单胞菌总丰度的差异，以及细菌分支水平上总和的丰度模式的差异（丁香假单胞菌与荧光假单胞菌；Fig. 3b）。田间试验发现昆虫取食下丁香假单胞菌和整个假单胞菌属的丰度增加。温室试验结果突出表明，诱导植物防御来抵御昆虫取食是一种潜在的机制，昆虫取食通过该机制可以导致野荠菜叶片微生物组中细菌类群的扩增。

值得注意的是，与空白处理的叶片相比，JA处理中两种菌株（22B和20B）在宿主体内的适应性显着降低（Fig.3a–b）。当考虑较大的分类单元属或科分类时，这种昆虫取食所驱动的丁香假单胞菌的适应性变化是无法检测到的（Fig.3），其中低分辨率工具（例如16S测序）往往会将局部丰度增加的菌株类型归结为总体广泛分类丰度的增加。因此，诱导植物防御昆虫取食会导致在该寄主种群内丁香假单胞菌的扩增和数量优势（Fig.3c）。这种变化导致在JA处理叶片中的Shannon evenness降低（Fig.3d）和总体群落分散度的降低（Fig.3e）。

图3 激活植物对昆虫取食的防御会改变植物内部病原菌的表现

5 在昆虫取食严重的植物上植物病原菌的扩增明显增大

分析发现丁香假单胞菌群中高度丰富的单个bASV假单胞菌3与野荠菜被昆虫取食的水平相关。在NP试验点对取食较为严重的植物进行分析（图4a，顶部边缘密度图），发现与取食较少的植物相比，取食程度的增加导致假单胞菌3的局部密度的预计富集达到50倍（图4）。进一步分析发现，在NP试验点，一半以上的假单胞菌3种群仅定殖于野荠菜种群中五分之一的植物中。

6 昆虫取食-细菌共聚集与植物适应性降低有关

在NP位点，植物的昆虫取食强度越高，繁殖成功率越低，且取食最严重的植物所产生的果实数量是未受到昆虫取食植物的一半（图4b）。虫害更多的植物往往具有更高水平的细菌感染。因此，果实的稳定变化与自然天敌（取食昆虫和植物病原菌）的共聚生物胁迫紧密相关。

图4 昆虫取食与植物病原菌共侵染的加剧与植物较低的繁殖能力有关

7 天然植物种群中草食动物聚集的原因

在NP试验点植物之间的昆虫取食的聚集程度在植物个体之间显著变化；用植物防御激素SA或JA进行早期季节处理对昆虫取食危害的边际影响很小。SA和JA处理均高于对照处理，但两种激素作用的后验分布重叠为零。因此，虽然先前的植物暴露于JA和可能的SA可能会导致植物被昆虫取食的几率增大。此外，这些植物水平的防御激素处理（叶片采样前五周）对总体或科水平上细菌丰度的γ分布没有明显影响。

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