综述 | 工程化设计微生物群落中的化学物质互作（IF:40.812）
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导读
生活在宿主相关微生物群落内的微生物依靠化学物质的交流与周围生物相互作用。这些相互作用有许多用途，从向多细胞宿主提供营养物质到拮抗入侵病原体，化学信号物质的分解对宿主和微生物群都有潜在的负面影响。将微生物进行工程化设计使之参与化学物质互作有主意更好的理解复杂群落里的化学信号调控。在这篇综述中，我们讨论了在宿主相关微生物群落中发现的化学相互作用的典型范例，特别是植物根微生物群和动物的肠道微生物群。然后，我们重点阐述了对这种互作机制的理解是如何指导微生物参与这些生境中的化学信号传导的。我们讨论了在化学物质的互作可以促进宿主定殖，促进宿主健康生长，以及抵抗病害的情况下工程化微生物的思路方法。最后，我们描述了该领域面临的突出挑战，并预测了未来工程化微生物的研究方向。
论文ID
原名：Engineering chemical interactions in microbial communities
译名：工程化设计微生物群落中的化学物质互作
期刊：Chemical Society Reviews
IF：40.812
发表时间：2018
通信作者：Emily P. Balskus
通信作者单位：哈佛大学，化学与化学生物学系
综述内容
1.引言
含有细菌，古细菌，真菌和病毒的微生物群落无处不在，最近的估计表明微生物种类超过了1万亿（1012），远远大于估计的动物数量（777万）和植物物种（298000）的总和。多细胞生物与微生物群落一起进化，大多数情况下微生物可以定殖于多细胞生物体。这些由寄生，共生和致病生物组成的宿主相关微生物群落称为微生物群。久而久之，微生物通过产生并感知小分子形成了相互通信和与周围生物相互作用的机制。在与宿主相关的微生物群落中，这些化学信号不仅来自微生物，还来自宿主本身。这种连续的信息传递对宿主和群落微生物有很多用途。在微生物群落中存在着维生素和营养成分等小分子的交换，这些代谢物可以促进群落中微生物的生长（图1A）。生物从另一物种的产物中获益的营养相互作用（也称为交叉喂养或同型饲养）是许多宿主相关群落的重要驱动力，其中多种微生物的收集物和宿主会产生很多种分子物质。例如，多型拟杆菌是人类肠道微生物群的一个重要成员，需要类咕啉辅助因子才能进行重要的酶促反应，但自身无法合成这些分子。但它能够编码三种不同的B12运输系统，这些系统可以导入由邻近的肠道微生物产生的类咕啉辅助因子。在土壤中，荧光假单胞菌BBc6R8和真菌Laccaria bicolor S238N之间的相互作用是由真菌产生的海藻糖二糖和细菌产生的硫胺素的转移介导的，这种互作可以促进两者的生长。除了微生物-微生物相互作用外，还存在宿主与其相关微生物之间营养互作的例子。
除了涉及养分物质交换的相互作用之外，化学相互作用还可用于协调相同或不同物种的微生物之间的反应。比较典型的例子就是群体感应，这是一种细胞-细胞之间的交流过程，允许微生物根据种群密度协调转录层面的应答（图1B）。其他类型的小分子信号传导则允许细菌和宿主对邻近生物产生的特定分子作出响应以适应周围环境。这种种间交流可以采取多种形式，从宿主衍生的分子作为信号触发致病细菌从而上调定殖所需的基因，到细菌衍生的酰基高丝氨酸内酯（AHL）诱导宿主免疫应答和生长的变化。微生物也会采用小分子之间的相互作用来拮抗群落的其他微生物成员。产生抗菌小分子是微生物用来阻止竞争者的常见方法（图1B）。例如，切叶蚂蚁的细菌共生体可以产生大量抗菌和抗真菌小分子，用于保护宿主及其宿主的食物来源免受入侵病原体的侵害。微生物还可以通过影响周围环境中小分子的丰度来干扰竞争对手。对环境中有限养分的竞争是决定微生物定殖能力的主要因素。微生物中特定的金属吸收系统使它们能够结合金属并促进对环境中关键金属的吸收，有效抑制了竞争微生物获取所需养分的能力，从而在群落中稳定存在（图1A）。此外，细菌也可以破坏他们邻近的群体感应系统。虽然宿主相关微生物和宿主都会从这种共生关系中获益，微生物产生的小分子也可能对宿主有害（图1B）。
图1 微生物群落中小分子信号传导的模式。（A）营养相互作用。（B）信号交互
通过对宿主相关微生物群落中化学物质互作的研究与理解，我们能够对这些互作模式进行模仿或调节以造福宿主。这可以通过在这些复杂的生态系统中添加外源产生的小分子来实现。典型的范例包括使用肥料替代固氮细菌作为植物生长的氮源，以及使用抗生素天然产品制成的药物对抗细菌病原体等。近来，通过改变宿主相关微生物群落的组成从而改变其功能得到了额外的关注。最显著的例子就是采用移植粪便微生物群的方法来治疗复发性艰难梭菌感染。患者在抗生素给药后对艰难梭菌变得敏感，这使肠道微生物群的组成从健康状态转变为不平衡状态或失调状态，代谢产物也相应发生变化。在这些病例中，高达30％病例显示施用抗生素对于恢复微生物群落的平衡无效。粪便移植是指将健康供体的完整的肠道微生物群落转移给患者，使微生物群落回到健康状态。第一轮给药后，这种治疗的成功率达到85-90％，第二轮治疗后成功率几乎达到100％。有趣的是，一项小型试验研究表明向艰难梭菌患者添加过滤后的粪便上清液也可以取得类似的效果，说明除了移植完整的微生物群落，分泌的分子也是使患者肠道微生物恢复到健康状态的调节因子。类似的研究也表明将健康土壤中的微生物移植到发育不良的土壤中可以在6年的时间内恢复植物的生物多样性和生态系统健康。
现代基因调控工具的发展提高了利用工程微生物调控群落化学物质互作的可能性。这种方法可以解决使用小分子或复杂微生物群落操纵微生物群的一些局限性。工程化微生物使之可以连续产生有效的药物分子，从而免除了重复给药或再次敷用的需要。也可以对微生物进行工程化设计，使其仅在特定刺激下产生所需的化合物，从而更有效的控制给药过程。对整个微生物群落的移植包括了一些未鉴定功能的和对宿主有潜在不利作用的微生物，与之相比，施用单一工程菌或特定群落能够更好的预知与控制产生的群落。实施这种方法不仅需要先进的基因工程方法，还需要了解感兴趣的群落中发生的特定化学相互作用及其生物作用。随着这两个研究领域的发展，未来可以通过设计特定的化学相互作用达成各种期望的结果，包括改变微生物群落的组成，增加对病原体的抵抗力，以及向宿主提供营养等。
在这篇综述中，我们强调了在宿主相关微生物群落中，工程化单个微生物菌株参与化学相互作用的最新进展。我们主要从植物根系微生物群和动物肠道微生物群这两种类型的群落中举例，旨在提炼出成功设计微生物参与这些复杂生境中化学物质互作交流的共同原则。这一分析将有助于指导未来合成生物学领域的工作。这里我们只关注改变小分子介导的相互作用的研究工作，强调每个例子背后的目标和工程原理，而不是使用的基因技术。本文也不涉及为小分子检测设计细菌生物传感器的工作。
2. 宿主微生物群落中的化学相互作用
在这里，我们讨论了植物根系微生物群和动物肠道微生物群的相同和不同之处，重点介绍了微生物-微生物和微生物-宿主化学物质相互作用的例子。在比较和对比这两种不同的群落时，我们希望提炼出超越群落的普适概念，希望它们能普遍应用于其他微生物群，包括在其他宿主中发现的微生物群。
2.1 植物相关根微生物群
土壤中地球上最多样化的微生物群落（图2A）。除根际微生物外，植物根系微生物群还包括植物组织内的内生菌、共生菌、古生菌和真菌。虽然迄今为止在所有植物种类中都发现了内生菌，其在许多情况下的确切功能尚不清楚。根系微生物群内微生物多样性的驱动因素包括基因型、宿主植物的年龄和健康状况、周围土壤的营养成分、pH和湿度以及群落中其他微生物的特征等。最近的研究检测了与许多不同植物相关的微生物群落，从模式植物拟南芥到梅洛葡萄树和柑橘树，每种植物都具有不同的核心微生物群。通过从根部产生和排泄小分子，植物可以优先富集根系微生物群落中的特定微生物。这种称为根系分泌物的分泌分子构成了植物固定的总碳的21%，包括碳水化合物、氨基酸、激素、次级代谢产物和其他有益于土壤微生物的化学引诱剂或营养分子。
利用植物遗传学的手段研究了一些影响根微生物群落组成的小分子之间的相互作用。具有多种突变途径的植物具有不同的根系微生物群。对缺乏产生或运输根分泌物（包括植物激素水杨酸）的拟南芥突变体的研究表明，根际微生物群的组成发生了变化。虽然植物能够通过产生小分子来影响根系微生物群落的发育，但这些微生物也在维持和促进宿主的健康方面发挥着重要作用。研究表明根系微生物对植物生长的促进作用可以通过多种机制发生。这些微生物为植物宿主提供关键营养，调节关键的植物激素水平，提高抗旱性，并通过产生抗生素和调节宿主的免疫反应来抵御病原体入侵。
对根系微生物群促进植物生长研究最充分的机制是在豆科植物根瘤中共生固氮（SNF）过程中微生物辅助的宿主营养获取（图2）。根瘤是根上形成的特殊器官，含有多达109种细菌。植物不能利用大气氮（N2），因此需要氨或硝酸盐合成重要的含氮有机分子，如氨基酸。豆科植物依靠根瘤内的氮同化内生菌提供这种关键营养物质。这些微生物利用依赖于钼和钒的固氮酶来催化N2转化为氨。氨从细菌细胞运输到植物组织，植物组织中的氨同化酶，例如谷氨酰胺合酶，谷氨酰胺合成酶和天冬氨酸氨基转移酶等可以将氨结合到有机分子中。之后氨基酸从结节运输回到植物根部，为宿主植物提供可用的氮源。
除了提供关键养分物质外，根微生物群还可以通过抑制病原体而促进植物健康。根系微生物主要通过两种主要方式防止植物受到病原体的侵害：一是通过产生拮抗病原体的化合物，二是通过合成有助于增强植物抵抗力的分子。以抗菌化合物2,4-二乙酰基间苯三酚为例，它由某些荧光假单胞菌菌株产生，研究表明这种物质可以保护小麦植物（Triticum aestivum）免受真菌物种小麦赤酵母的的危害，后者是对根具有破坏性的病原体（图2）。微生物保护植物抵御病原体的另一个主要机制是诱导系统抗性（ISR）。根系微生物群落启动了植物免疫系统，加速其对广谱病原体的防御，就会发生ISR。细菌可以通过产生小分子来引发这种ISR反应。植物对微生物相关分子模式（如脂多糖和鞭毛蛋白）的识别都能够引起ISR反应。ISR反应也可被其他微生物代谢产物激活，如先前讨论的抗真菌化合物2,4-DAPG、AHLS和铁载体，这表明小分子的产生可同时通过多种机制对保护植物。
图2 植物根微生物群中的小分子信号。（A）植物根系微生物群由根际自由生活微生物和生活在植物根部（内生菌）内的微生物组成。 （B）植物根微生物群内植物-微生物和微生物-微生物化学相互作用的实例。
2.2 人类肠道微生物群
与根际微生物群一样，人类微生物群也含有多种多样的微生物（图3）。就像植物物种之间微生物群存在差异一样，不同动物的肠道微生物群组成也不同。与植物根际微生物群落一样，养分有效性在人类肠道微生物群的组成和代谢功能方面起着非常重要的作用。宿主饮食是人体肠道微生物的一个重要营养来源。已有许多研究探索了饮食对肠道微生物群组成的影响。上述对动物微生物群的调查揭示了肠道微生物群多样性与宿主饮食之间的关联，结果表明比起食肉动物，食草动物在属水平的微生物多样性更为丰富。
与植物类似，人类宿主也可以直接向其肠道微生物群的成员提供营养。以肠上皮细胞（IECs）中的fut2酶对糖蛋白的岩藻糖基化作用为例。肠道内的微生物可以通过ɑ（1，2）岩藻糖苷酶的作用水解宿主岩藻糖基化糖蛋白的L-岩藻糖，作为肠道内各种细菌的能量来源。已知的肠道微生物代谢的其他宿主衍生分子包括其他聚糖（母乳低聚糖）、宿主蛋白（粘蛋白）和胆汁盐。除了饮食和宿主代谢物外，肠道中的微生物也会为邻近群落提供重要的营养。这些营养相互作用可以解释肠道中许多不同微生物的共存现象。
不同来源的化合物支持着肠道微生物群，同时肠道微生物也可以为宿主提供营养。微生物可以给宿主提供来自食物的额外能量，这些能量不能被宿主酶分解，典型的例子是将膳食淀粉发酵成的短链脂肪酸（SCFA），包括醋酸盐，丙酸盐和丁酸盐（图3）。虽然这些SCFA作为信号分子对哺乳动物宿主具有多效性，但它们也是肠上皮的重要能量来源。哺乳动物肠道微生物群还具有拮抗病原体和保护宿主免于感染的能力。
产生抗生素可能是人类相关微生物群落中抑制病原体的另一种普遍机制。从人皮肤分离出的细菌卢格登氏葡萄球菌产生的环肽抗生素卢格登宁，对人类病原体金黄色葡萄球菌有抵抗活性（图3）。微生物还可以通过影响宿主免疫系统的发育而影响宿主对病原体的反应。肠道微生物群代谢物也驱动某些特定类型的免疫细胞的发育。肠道微生物也可以改变宿主细胞中免疫系统相关基因的转录水平，增加宿主对入侵病原体的耐受性（图3）。细菌代谢物吲哚向肠上皮细胞发出信号，促进产生紧密连接蛋白，导致相邻上皮细胞之间的屏障增强，从而降低病原体穿过该细胞屏障的能力。
图3 人类微生物群中的小分子信号
3. 宿主相关微生物群落中设计微生物化学相互作用
在这一部分，我们将讨论采用基因工程设计细菌实现以下三个主要目标的普适策略：（1）通过利用从前难以利用的营养相互作用使之定殖于宿主并稳定地整合到现有的微生物群落中，（2）通过调节小分子相互作用促进宿主生长以及（3）通过产生小分子防止宿主感染病原体。
3.1 有益于定殖宿主的化学物质相互作用
微生物群落工程的主要挑战之一是如何将微生物稳定地引入已建立的与宿主相关的微生物群中。植物和人类微生物稳定定殖所需的具体条件尚不清楚。因此，外源生物通常不能在这些群落中长时间存在。已有研究发现了影响植物根系微生物群定殖的遗传决定因素。而对于植物和动物微生物群落的研究表明在微生物定殖方面可能存在一些普遍性的基础。通过研究在小鼠肠，蜜蜂和短尾鱿鱼到拟南芥植物根部的多种环境定殖所需的基因，发现一些与初级代谢相关的基因能够影响微生物定殖。这一结果意味着，竞争有限营养物质的能力可能对于生物在微生物群落的稳定存在至关重要。Yang等的研究结果表明，在复杂的宿主相关微生物群落中，提高工程化微生物利用营养物质的能力可能有助于提高微生物竞争力。
确定了对定殖于宿主很重要的营养途径之后，合理的工程化设计方法可以提高细菌利用这些养分的能力。通过内源性基因的过表达和新功能的添加，设计过的微生物可以成功融入群落并参与关键营养物质的交换。以营养物质铁为例，在人类和植物相关的微生物群中，宿主与微生物竞争有效铁。在人类中，游离Fe3+通过铁结合蛋白如转铁蛋白、乳铁蛋白和铁蛋白等与致病微生物隔离开来。一些植物也使用螯合策略（策略二）来隔离铁。尤其是禾本科的成员产生一种叫做植物铁载体的小分子Fe3+螯合剂，通过形成铁-铁载体复合物使Fe3+溶解。大多数非禾本科植物采用的另一种获取铁的方法（策略1）包括对周围根际进行酸化，将Fe3+还原为Fe2+，以及主动输入可溶性Fe2+等。微生物也可以产生一系列称为铁载体的小分子Fe3+螯合剂，它们可以在铁不足的条件下合成并释放到环境中（图5a）。微生物铁载体对铁有很强的亲和力，通过与环境中不溶性Fe3+结合，或在某些情况下Fe3+与低亲和力的铁载体和铁结合蛋白结合，从而生成铁-铁载体复合物。（图5b）。通常情况下，通过具有铁黄素还原酶活性的酶将进口铁黄素结合的Fe3+还原为Fe2+。因此，可以设计细菌使之合成亲和力更高的铁载体。或者也可以设计细菌使其能够利用邻近微生物或宿主已经产生的铁载体。
图5 对铁载体利用基因的操纵促进植物根系微生物群中的工程微生物生长。（A）在植物根微生物群中发现由细菌假单胞菌WCS358产生的铁载体假单胞菌素358和由真菌玉米黑粉菌产生的铁色素。（B）细菌假单胞菌WCS358中的铁载体运输
3.2 有益宿主健康的化学物质相互作用
以维生素A为例，虽然维生素A可以从许多食物中获得，但维生素A缺乏症仍然是世界上很大一部分人口面临的一个重要问题。因此可以设计一种益生菌，使其能够稳定在宿主定殖并直接补充维生素A。Wassef等人通过表达植物相关细菌成团泛菌的四种生物合成酶，设计大肠杆菌MG1655的肠道适应菌株来生产β胡萝卜素，后者是维生素A的前体物质（图6）。这种补充维生素的方法可以推广应用到其他维生素和营养不足的情况。除了提供膳食化合物外，还可以设计微生物使其合成宿主衍生的分子（例如小肠中产生的宿主衍生代谢物N-酰基乙醇胺NAES）。
综上，可以通过设计微生物使之促进宿主产生代谢产物并促进宿主的健康生长。这一方法也同样适用于宿主遗传学导致的酶功能受损的情况。此外，还可以设计微生物使其产生群落中其他微生物产生的分子物质。在干旱等环境压力下，植物促生菌也有利于维持植物健康。
图6 工程化大肠杆菌MG1655 产生的维生素A表达来自成团泛菌的β-胡萝卜素生物合成途径。
3.3 抵御病原体的化学物质相互作用
宿主相关的微生物群落会阻止入侵的病原体在宿主定殖。进入寄主相关微生物群落的病原体可能会受到营养限制以及寄主微生物产生的抗菌化合物的影响。通过了解特定病原体的群体感应系统如何工作，可以设计共生微生物来干扰这些过程从而有效抵御病原体入侵宿主。还可以改造细菌以改变其产生抗微生物化合物的特征，以更精确地靶向特定病原体。绿脓假单胞菌PCL1391通过产生抗真菌化合物PCN拮抗番茄真菌病原体尖孢镰刀菌（图8A）。通过基因工程设计的微生物产生的抗菌化合物不仅能够针对入侵的病原体发挥作用，微生物群落的其他成员也可能会受到影响。为了降低这种影响，可以设计成窄谱抗生素或将抗菌化合物与特定靶病原体联系起来。
总之，宿主相关微生物群落中微生物之间的化学交流非常复杂。人类肠道包含多达1000种微生物种类，每一种都具有其独特的生物合成能力。虽然我们目前对宿主相关微生物群中化学信号传导的研究仍主要集中于病原体-共生相互作用，但了解这些宿主相关微生物如何依赖种间和种内化学信号传导将有利于更精确地设计化学物质相互作用。
图8 设计土壤微生物以产生抗真菌化合物吩嗪-1-甲酰胺预防疾病。（A）荧光假单胞菌2-79和金黄色假单胞菌30-80产生吩嗪-1-羧酸（PCA），其对真菌病原体尖孢镰刀菌没有影响。（B）通过转酰胺酶PhzH将PCA合成PCN。（C）与接种野生型荧光假单胞菌或没有细菌相比，用表达phzH的荧光假单胞菌接种的番茄种子在尖孢镰刀菌攻击后疾病百分比最低。
4. 展望
4.1 使用工程微生物调节微生物群落中化学相互作用的益处和缺点
与直接施用小分子相比，工程化微生物实现了更廉价且可重复的施用方式。此外，如果微生物可以定殖在与宿主相关的微生物群落中的适当位置，它们可以在预估的作用位点产生分子或修饰化学信号。设计单一微生物作为调节化学相互作用的方式相比改变整个微生物群落更为有效。尽管如此，这一方法仍存在一些需要解决的难题。首先，我们对决定微生物定殖的因素的了解仍然非常有限，并且仍然依赖于微生物/群落。另外，把工程生物投放到天然微生物生态系统中会造成什么后果尚属未知。我们对于工程微生物参与化学信号传导的全部潜力还没有深入透彻的了解。通过合成生物学的进展来控制微生物在群落中的行为，基因改造多种生物体，并通过研发更易识别有关化学信号传递的基因的方法，有可能扩大这种方法的适用范围。
4.2 将先进的合成生物学方法应用于未来微生物设计过程
利用工程微生物来控制化学信号的一个主要好处是它具有生物感知和响应环境的能力。通过将工程微生物中的基因表达与环境刺激物的存在联系起来，这些生物体可以根据周围环境来决定如何调节化学相互作用。另一种将细菌自然进化的小分子与转录反应联系起来的方法是使用双组分调节系统。这些不同系统的传感元件通常是膜结合组氨酸激酶。小分子与传感器的结合触发组氨酸的自磷酸化，随后磷酸转移到相应的反应调节器，改变转录水平的输出。除了研究新的生物通路来控制工程微生物中的化学信号外，合成生物学还可以在扩大微生物宿主的范围方面发挥作用。
未来微生物设计过程应该优先考虑研究那些已经适应寄主相关利益群体的微生物。许多内生生物不仅可以更好的定殖在微生物群落内，对宿主和邻近的微生物也有益处。未来工作的重点应该放在如何修饰DNA以及研发设计针对广泛微生物发挥作用所需的基因片段。
4.3 将微生物群落中小分子和代谢过程与微生物基因联系起来
组学技术包括16S rRNA测序，全基因组测序，转录组学以及代谢组学可以让我们了解哪些营养物质可以提供给微生物，哪些微生物代谢物是产生的。利用比较基因组学鉴定那些存在于基因组中与关键代谢活动相关的基因，成功地鉴定了新基因的功能，其中包括那些负责蓝藻中富含能量的烷烃的基因。宏基因组测序的发展大大促进了酶的发现与鉴定。功能宏基因组学可以将微生物活动与新基因以及酶联系起来，包括从单一物种或微生物群落中提取的DNA的异源表达，以及随后测定所得克隆文库的目标表型。从复杂天然产物的生物合成到含有丰富代谢物的简单转化仍然存在许多未被发现的微生物途径。对微生物群落的代谢能力的全面了解将有助于未来更有效的微生物工程设计工作。
5. 结论
本研究展示了将小分子介导的相互作用应用到多种宿主相关微生物群的前景。虽然已有很多成功的例子，但仍然存在着限制其应用的一些主要障碍。事实上，应用工程微生物进行蛋白质和核酸的传递已经大大超过了其在操纵宿主相关微生物群落中的小分子方面的应用。克服这些挑战将极大地促进未来的工程化微生物工作，并使这种微生物群操纵方法具有更好的有效性和普适性。
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