干细胞的制备与鉴定

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干细胞的体外培养特性

与一些成熟细胞相比，干细胞的体外培养条件要求相对苛刻，因为它在体外培养条件下容易自然分化而失去干细胞的基本特性。干细胞的体外培养难点是既要维持干细胞的“干性”，又要令其增殖而保持未分化状态，这本身就是一对矛盾。由于不同来源的干细胞，其生长特性差异较大，体外培养条件也有一定差别，一般需要根据不同类型的干细胞建立相应的个性化培养体系，特别是将某种干细胞建成细胞系，更需要建立稳定的培养技术。体外制备干细胞包括干细胞或富含干细胞的材料采集、分离纯化、扩增、鉴定及储存等过程，分离、培养过程需要在无菌层流实验室中进行，需要在培养体系中添加一些维持其“干性”和促进增殖的因子。

胚胎干细胞的体外分离培养原始材料来源包括受精卵发育而来的桑葚胚、囊胚内细胞团、胎儿生殖脊等。

体外制备包括以下过程：

①原始胚胎干细胞的获取：采用机械法分离、胰酶或胶原酶消化获得原始胚胎干细胞悬液。

②细胞传代培养：将细胞悬液接种在改良的Eargle培养液中培养2~3天，然后转移到经放射线照射或丝裂霉素处理的成纤维细胞饲养层上进行传代培养。由于处理后的成纤维细胞失去了增殖能力，但还能分泌多种细胞因子，可维持胚胎干细胞的“干性”和促进其增殖。饲养层细胞一般采用3T3、STO等小鼠细胞系，也可采用自制的胎鼠成纤维细胞。培养体系中，一般还需要添加适当浓度的胎牛血清（FBS）、非必需氨基酸、β-巯基乙醇、白血病抑制因子（LIF）、干细胞因子（SCF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等，其中LIF具有抑制胚胎干细胞分化的功能。为防止细菌污染，可按其他细胞培养体系的要求加入双抗。胚胎干细胞在培养体系中呈克隆生长，待单个细胞长成集落后，挑取细胞集落，用低浓度的胰酶消化分散后，继续用上述培养体系进行传代培养。经反复传代培养，可获得高纯度的生长旺盛的胚胎干细胞。如果撤除培养体系中的血清成分，胚胎干细胞会自动分化形成拟胚胎体，其中含有多种类型的组织细胞，说明血清中可能含有维持胚胎干细胞特性的因子。

③细胞鉴定：对细胞的生长特性、表型标志、核型、细胞周期、分化潜能进行分析鉴定。

④胚胎细胞储存：将胚胎干细胞置于含有10%二甲基亚砜（MDOS）的胚胎干细胞培养液中，按常规方法程序降温，最后置于-196℃液氮中长期保存。最近些年还开发出一些无血清的干细胞培养基，实验证实干细胞在这些培养基中生长良好，避免了添加血清中携带病原的可能性，减少了胚胎干细胞在体内研究与应用中的干扰因素，为临床应用奠定了基础。基因导入或小分子化合物等诱导培养获得的胚胎干细胞样细胞，其培养、扩增条件与胚胎干细胞相似。优化胚胎干细胞的培养条件，研究更为高效的培养基，特别是不含血清的培养基仍然是胚胎干细胞研究的重要方面。

成体干细胞的种类繁多，几乎在所有组织中均发现有干细胞存在，不同组织来源的干细胞在数量、细胞形态、生长特性、表型标志、分化条件及分化潜能上千差万别，体外培养条件要求不尽一致，很难建立一套适用于所有成体干细胞培养的通用技术方案，需要针对不同类型的成体干细胞建立“个性化”体外制备技术。由于成体干细胞可以来源于自体，避免了免疫排斥和胚胎干细胞涉及的伦理及安全问题，在临床上具有优先应用优势，因此在2000年以来受到高度重视，在体外制备技术方面取得了诸多突破性成果，极大地促进了成体干细胞技术产业的发展和转化应用。

成体干细胞体外制备通常也包括材料采集、分离纯化、体外扩增、诱导分化、储存、复苏等关键技术环节。在采集获得成体组织之后，根据组织来源及特性，分别采用机械分离、密度梯度离心、酶消化、免疫磁珠分离、流式细胞术分离等方法分离制备成单细胞悬液，然后将其置于特定的培养体系中进行原代和传代培养，培养体系中一般也要加入维持“干性”和促进其生长的细胞因子，例如干细胞因子（SCF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等。为进一步纯化干细胞，在培养过程中根据干细胞的特性进行贴壁培养、差速贴壁、克隆筛选、免疫吸附等办法进一步纯化和去除杂细胞，例如利用间充质干细胞贴壁生长的特性进行贴壁培养可获得骨髓、脂肪、脐带等组织中的间充质干细胞，采用差速贴壁法可去除其中的少量成纤维细胞。

有一些成体干细胞可采用组织块培养法获得，方法是将组织剪碎成小于1mm³大小的组织块，将其接种于培养瓶底，先加入少量培养液，待组织块贴壁后再补充培养液继续培养，其中的干细胞可沿组织块周围长出，然后去除组织块并进行传代扩增获得大量干细胞。这种方法适用于脐带间充质干细胞等贴壁生长较快的干细胞，同一组织块可进行反复培养。骨髓、脐血组织中的造血干细胞一般采用流式细胞术、免疫磁珠法可分离获得纯度大于99%的造血干细胞，但体外扩增相对困难，一般要在半固体培养基上进行扩增，培养基中需要添加血清、多种促进其生长的因子。也有人认为，在干细胞培养体系中添加血小板生长因子可促进干细胞生长，甚至可以取代血清添加。还有一些干细胞在体外培养体系中适于悬浮生长并形成悬浮细胞球，例如海马神经干细胞、视网膜神经干细胞等。总之，成体干细胞的分离主要利用其生长特性进行选择性培养或依据相对特异的标志性细胞表面抗原进行免疫学筛选，体外扩增则需要根据其生长特性建立不同的培养体系和技术方法，培养体系中需要添加促进生长和维持“干性”的细胞因子，否则传代培养后，干细胞会自动分化和老化而失去活性。

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干细胞的鉴定

主要依据其在形态特征、细胞成分与结构、基因修饰与表达差异、生长特性、表型标志、体内外分化潜能等方面与成熟细胞的差异，分别采用光学显微镜观察、电镜观察、免疫组织化学、组织病理观察、流式细胞术、基因结构与开放表达、表观遗传分析等技术，从不同侧面建立干细胞的鉴定技术方法、指标体系和标准。从概念上讲，干细胞的最基本特征是自我更新能力和多向分化潜能，增殖能力是考察干细胞活性的重要依据，而在体内外是否能够向多种类型的成熟细胞分化则是认定干细胞的“金标准”。因此，胚胎干细胞重点分析其全能性，而成体干细胞则重点分析其是否能够向2种以上不同组织类型的成熟细胞分化，特别是是否能够分化为不同胚层的功能细胞。

体外长期培养的胚胎干细胞鉴定：

①形态、结构特点：呈圆形或梭形，也有一些呈多角形，体积小，细胞核大，胞质少，可见一个或多个细胞核，细胞结构相对简单，细胞质内除有大量游离的核糖体和线粒体外，其他细胞器很少。

②生长特性：小鼠的胚胎干细胞呈巢式或集落式生长，边缘光滑，细胞排列紧密。人胚胎干细胞的克隆生长特点与恒河猴等灵长类动物的胚胎干细胞相似，细胞形态呈扁平，细胞之间呈紧密连接，易被胰酶消化，但灵长类动物的胚胎干细胞呈松散连接。

③表型标志：胚胎干细胞表达胚胎阶段特异性抗原（SSEA）和癌胚胎抗原（CEA），但表达模式具有种属特异性。人和灵长类动物ES细胞表达SSEA-3、SSEA-4，不表达SSEA-1，人生殖脊干细胞（EG）则表达SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4，小鼠以表达SSEA-1为主。胚胎干细胞高表达碱性磷酸酶，碱性磷酸酶染色呈强阳性。还表达干细胞因子（stem cell factor）、生殖细胞核因子（germ cell nuclear factor）、转录因子 Oct3/4、端粒酶、高分子糖蛋白TRA-1-60和TRA-1-81、CD30、GCTM2、GenesisDG等。利用这些差异和表面标志物，可以验证胚胎干细胞。

④体外分化能力：主要包括拟胚胎体的形成和定向分化潜能分析。从胚胎干细胞培养体系中去除饲养层和分化抑制因子后继续培养，可自动形成拟胚胎体，其中包含有内外胚层的三微结构团块。继续培养还可以形成含有体腔的囊装拟胚胎体，其中含有内、中、外3个胚层的血管、神经、肌肉、腺体、骨等微型组织和多种谱系的细胞。在撤除饲养层和分化抑制因子之后，向培养体系中添加特定的诱导因子，包括小分子化合物、生物活性因子或物理因素，均可诱导ES细特定类型的成熟细胞分化并表达相应的特异性抗原标志，具有相应的细胞功能。

⑤体内分化潜能：将ES细胞移植到免疫缺陷小鼠，如SCID鼠、裸鼠皮下后，可逐渐长成畸胎瘤，组织学观察可见内、中、外3个胚层的组织和细胞，对组织切片进行免疫组织化学染色，可见多种类型的成熟细胞。将胚胎干细胞通过显微注射技术注射到其他正在发育生长的囊胚内细胞团中，可以培育出嵌合体动物，胚胎干细胞可随胚胎发育进入各种组织并向相应类型的功能细胞分化，整合于组织之中并发挥功能，而且也可以分化为生殖细胞，具有生殖系传递功能。如果将胚胎干细胞定位移植到成体的特定组织中，它可以在组织微环境的诱导下“入乡随俗”，定向分化为所在组织类型的功能细胞，例如将胚胎干细胞移植到帕金森动物模型的纹状体中可分化为能够产生多巴胺和5-羟色胺的神经元样细胞，使帕金森症状改善。

成体干细胞的鉴定相对困难，因为缺乏特异性的抗原标志物，生长特性和形态各异，分化潜能不如胚胎干细胞大。尽管在许多组织中存在干细胞，但由于其数量很少，且与组织中的其他细胞无明显的差别，无法清楚地区分它们。因此，在各种不同的组织中如何科学地区分这些种类稀少的干细胞，或者如何发现一有效简便的鉴别方法，是干细胞研究人员所必须解决的问题。过去人们普遍采用的鉴别干细胞的最基本且可靠的实验手段是利用干细胞最显著的两个特征，即慢周期性和自我更新能力，来鉴定在体与离体干细胞。由于干细胞的慢周期性，可采用标记滞留细胞的分析方法识别在体的静息干细胞。干细胞的自我更新能力在体外培养则表现为无限的增殖能力，形成细胞克隆，从而识别离体的干细胞。但这两种方法应用时具有一定的限制性。

主要鉴定方法：

①表型抗原标志分析：目前研究人员普遍采用的方法是依靠干细胞的表面标志来区分和鉴定各种干细胞，通过干细胞表面受体可以区分干细胞和其他细胞。成体组织来源的离体干细胞鉴定主要通过一系列阳性和阴性标志的分析，综合判定是否符合干细胞的表型。例如间充质干细胞表达CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD124、SH2、SH3等，而不表达造血干细CD106、CD124、SH2、SH3等，而不表达造血干细胞的抗原标志物 CD34、CD14、CD45等。利用干细胞表面受体来鉴别干细胞有两种方法，利用荧光素的化学特性和受体的独特的结构相结合的方法来鉴别干细胞群。

②体外定向诱导分化：一些生物活性因子、化学物质或组合因子可诱导成体干细胞定向分化，一些组织提取物也具有诱导成体干细胞定向分化的倾向，导入特定基因并令其高表达可稳定诱导成体干细胞分化为某种类型的功能细胞。要验证成体干细胞是否具有多向分化潜能，至少应考虑分化为3种以上不同组织类型的成熟细胞，选择定向诱导分化为不同胚层细胞分化方向，例如脐带、骨髓、脂肪来源的间充质干细胞鉴定常定向诱导分化为神经、脂肪、骨、软骨、肌肉等。

③体内诱导分化：成体干细胞接种于免疫缺陷动物皮下一般难以形成包含多种组织类型细胞的组织，一般是定向注射于特定的组织中，观察其是否可在组织微环境诱导下定向分化，例如注射入神经、肌肉、肝、骨髓等组织中，通过体内示踪、免疫组织化学、表型变化、功能分析等方法验证其在体内特定微环境中的分布和分化方向。对于单细胞生物和低等动物，可以很精确地通过其形态和定位而鉴别出其中的干细胞。例如在果蝇生殖腺和外周神经系统（PNS）中，干细胞和非干细胞的子代细胞对于其周围细胞已具有很明确限定的方向。而在人和哺乳动物的许多组织中，干细胞的位置、微环境结构尚不完全清楚，有些干细胞表面的分子标志未完全得到确定，寻找成体干细胞的特异性标志并为干细胞分离、鉴别提供新线索仍然是干细胞研究的重要方向。

随着基因结构、表观遗传和基因表达等分子生物学技术的发展，特别是大规模基因测序技术、表观遗传修饰分析及基因表达芯片技术的广泛应用，再加上大数据分析技术的不断普及，干细胞鉴定越来越精准、细致、全面。如利用生物芯片分析结合高通量基因测序技术分析干细胞相关基因的开放表达及表达谱分析干细胞的表型、功能，鉴别干细胞中特异性的基因和转录因子等。用PCR技术来鉴别具有活化的和导致细胞具有特性的基因的表达。这些技术有助于研究人员通过识别“基因标志”来区分干细胞。例如：PDX-1基因是一种转录因子蛋白，负责胰岛素基因的最初活化，研究人员通过识别它来鉴别出能发育成胰岛细胞的干细胞。还可利用基因工程技术结合荧光素技术而不依赖干细胞的表面标志来鉴别干细胞，这种技术的重要性就在于允许人们检测分化或定向分化时的干细胞。利用这种方法，可以进行早期的干细胞分离，在组织中识别出它们或在分化的过程中追踪它们。这些鉴别手段目前在许多实验室已被广泛应用，而且在未来的干细胞研究中将起主要作用，相信随着对干细胞的研究日益深入，将会探索到更为准确、省时的方法。