撰文：南山小仙
来源：干细胞者说
这两年，干细胞外泌体是真的很火啊。如果今年参加了美博会，您就会发现有很多号称添加外泌体的护肤品（为避免广告或被追杀，就不贴图了），或者是在宣传用外泌体做面部的医美项目。干细胞外泌体到底是什么，如何发挥作用，可否用在美容护肤上？经常会遇到爱美小姐姐的咨询，小仙每次都很认真的回复。然而，技术开发和市场宣传之间是有鸿沟的。我想，这是一个市场问题，科研人员也无需回避。堵不如疏，虽然目前在国家政策层面，干细胞及其衍生品治疗尚未开放；但在知识层面，我们应该要有正确的认识。文章比较长，希望各位朋友耐心读完。
现在，进入正题。当细胞活动的内在机制被破解，人类就有了破解生命之谜的密码。要说外泌体，我们先从“囊泡运输”的研究历史说起。
首先，我们对“囊泡运输”的研究历史进行了梳理：
1974年，发现溶酶体，发现分泌蛋白的合成、运输和分泌途径，可以称“囊泡运输”的最早研究，获诺贝尔生理学或医学奖。
1983年，在绵羊网织红细胞中，首次发现外泌体。
1985年，发现胆固醇代谢囊泡调控，发现“囊泡运输”中细胞膜受体的存在家，获诺贝尔生理学或医学奖。
1987年，外泌体正式被承认，被命名，从此它叫"exosome"。
1999年，发现分泌蛋白进入内质网需要信号肽引导，获诺贝尔生理学或医学奖。
2013年，发现并阐释细胞囊泡运输系统及其调控机制，获诺贝尔生理学或医学奖。
外囊泡三剑客
细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs） 是机体远距离细胞间交流的一种手段。目前主要被分为3大类：外泌体、微囊泡和凋亡小体，临床研究中主要关注的是外泌体。外泌体就是细胞外囊泡的一种。自此，外泌体研究成为国际研究热点。外泌体（exosome）是一类直径30-150nm，具有完整膜结构的细胞外囊泡，主要负责细胞间的物质运输和信息传递。南山小仙的画外音：外泌体是一种直径约 30 - 150 nm的纳米级囊泡，起源于细胞内吞过程中形成的内体，再从细胞中释放到胞外。几乎所有细胞都可以分泌外泌体。干细胞里有外泌体，肿瘤细胞里也有外泌体。
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外泌体的产生与作用机制
一开始，细胞膜内陷形成早期核内体。接着，细胞将一些颗粒物质装到早期核内体中，形成晚期核内体。最后，晚期核内体与细胞膜特定部位融合后形成芽泡，将泡体中的外泌体释放到细胞外。至此，外泌体完成分泌。外泌体可通过配体 - 受体相互作用，粘附到受体细胞表面，或者被受体细胞内吞或经过囊泡和细胞膜的直接融合，使外泌体内容物释放转移到靶细胞内。至此，外泌体完成从一个细胞到另一个细胞的转移。外泌体发挥生物学效应的方式主要有两种：一是直接作用。外泌体表面的蛋白分子或脂质配体直接激活靶细胞表面的受体，产生信号复合体并激活胞内信号通路。二是递送作用。外泌体可以与靶细胞的质膜融合或内吞直接进入细胞，将自身携带的蛋白质、核酸、脂质等活性分子带到细胞内，进而调控细胞的功能及生物学行为。我们以前的科普文章里对外泌体有一个很好的比喻：外泌体是一部货拉拉，装了自家一堆乱七八糟的东西（里面有miRNA，mRNA和lncRNA等小分子核酸，还有细胞因子等蛋白），然后分泌出细胞外，再接着进入另一个细胞，卸车完事。南山小仙的画外音：外泌体通过“吐出”和“内吞”机制发挥作用，直接由一个细胞产生，又可直接被另一个细胞捕获利用。
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外泌体的鉴定和提取
鉴定外泌体形态大小的一个常规手段是电镜观察，电镜下的外泌体呈典型的杯状形态。
电镜下的外泌体
有人总结过，外泌体提取方法包括：超速离心法、基于尺寸大小的技术、免疫吸附的分离技术、沉淀法、基于微流控的分离技术。
超速离心法是分离外泌体的标准方法。在4℃条件下依次以300G，2000G，10000G的转速离心，依次去除细胞和细胞碎片等，再以100000G超速离心得到外泌体。但离心法每次处理的样本量较小，而且反复高速离心会导致外泌体破裂影响质量。
几乎所有细胞都可以释放外泌体。如果这个外泌体是间充质干细胞分泌的，我们就叫间充质干细胞外泌体（MSC-exo）。MSC-exo表达所有外泌体共同表达的相关标志物：细胞骨架蛋白质（微管蛋白和肌动蛋白），同时也表达MSCs的表面标志物（如CD90、CD73）。
各种组织来源的MSC-exo
和间充质干细胞一样，MSC-exo也包含脂肪间充质干细胞外泌体、脐带血间充质干细胞外泌体、脐带间充质干细胞外泌体、骨髓间充质干细胞外泌体等。但无论是哪种来源的MSC-exo，其功能大同小异。当然，不排除有些外泌体具有组织特异性。南山小仙的画外音：间充质干细胞外泌体其实也很普通，只是众多干细胞外泌体中的一种外泌体而已。现在所谓的外泌体护肤，主要指的是间充质干细胞外泌体。
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干细胞外泌体与皮肤抗衰老
目前，干细胞外泌体在烧伤烫伤，难愈合性溃疡及术后创伤修复领域的潜在应用价值比较大。小仙对护肤方面的产品或技术特别有兴趣，而外泌体研究的一个重要方向就是延缓皮肤老化。通俗点，就是皮肤抗衰老，也就是解决人体自然衰老（内源性老化）和外界刺激衰老（外源性老化）的大问题。那么，到底外泌体在护肤方面有没有作用？且听小仙细细道来：我们先从皮肤衰老说起。人类皮肤的衰老是经历一个复杂的过程，主要是由内在机制和外在影响的相互作用导致引起的。皮肤衰老是从表皮层到真皮层的衰老，比如角质形成细胞增殖能力减退、成纤维细胞功能异常、乳头层变平、细胞外基质成分及含量的变化等是内外源性皮肤老化共同的病理生理改变。
健康肌肤与老化肌肤
内源性老化表现为皮肤干燥、出现细纹、胶原纤维和弹性纤维减少以及皮下脂肪变薄。这是正常皮肤老化，随着年龄增长自然发生的。外源性老化表现为皮肤干燥、出现大皱纹、皮肤松弛、弹性下降、粗糙、色素不均匀。这归因于环境因素，尤其是紫外线。
整个皮肤衰老的原因，通常归于基因变异，端粒异常，蛋白质和细胞损伤增加，炎症，细胞衰老加，内源性干细胞耗尽等问题。
二、如何对抗皮肤衰老
从理论机制上讲，实现抗皮肤老化的可能途径有促进角质形成细胞的迁移和增殖、促进成纤维细胞增殖、抑制基质金属蛋白酶（MMPs）活性和减少皮肤氧化应激反应。角质形成细胞是表皮层的主要细胞，决定表皮层的厚度，决定皮肤自愈能力的强弱。在皮肤损伤后第三天，成纤维细胞开始产生细胞外基质（包括纤连蛋白，I 型和III 型胶原蛋白等）。同时，上皮细胞开始增殖并向受伤区域边缘迁移，加速伤口闭合，减少皮肤感染。因此，细胞增殖和皮肤再上皮化对皮肤再生至关重要。研究表明，来自不同来源MSC-exo都可以促进皮肤细胞增殖，并加速表皮再生。体内实验也证明，脂肪间充质干细胞外泌体（ADSC-exo）可促进角质形成细胞在体外的迁移和增殖，提高皮肤伤口愈合速度，增加表皮的自愈能力。
1. 促进成纤维细胞的增殖能力
成纤维细胞是真皮层主要的细胞，可产生细胞外基质（ECM）。成纤维细胞在体内几乎不增殖，其功能受损及细胞外基质的改变与外源性皮肤老化密切相关。随着年龄增长，人体真皮层成纤维母细胞的数量和活性是呈现下降趋势。外泌体可增强成纤维细胞的增殖能力，具有浓度依赖性，可逆转紫外线诱导的成纤维细胞老化，但对内源性老化因素所致细胞衰老作用不明显。
2. 抑制基质金属蛋白酶（MMPs）
基质金属蛋白酶（MMPs）由成纤维细胞、内皮细胞等合成，主要负责细胞外基质的降解，尤其是构成真皮结构的胶原纤维与弹力纤维，故MMPs是调节皮肤光老化的主要靶标之一。MSC-exo对MMPs的调节能减少真皮层弹性和胶原纤维的损伤，改善真皮层老化。
3. 通过减少氧化应激来延缓皮肤衰老
紫外线辐射可产生大量ROS（ROS，即活性氧，是细胞代谢的产物，主要是各种氧化物，包括过氧化氢、超氧化物阴离子、羟自由基等），影响真皮成纤维细胞功能，诱导MMPs合成，损伤细胞外基质成分（如胶原蛋白、弹力蛋白等）。衰老成纤维细胞较正常细胞可产生更多ROS。研究发现，脂肪间充质干细胞外泌体（ADSC-exo）可减少ROS产生。外泌体在ROS的产生、清除上具有一定功能，通过抑制ROS能减少皮肤的氧化应激损伤，给改善皮肤衰老带来了新的希望。Cell Metabolism的一篇研究提到，年轻细胞分泌的小细胞外囊泡（sEV）可以通过减少氧化应激来改善老年细胞的衰老。从外泌体出发，利用外泌体蛋白质组学技术阐明了年轻细胞的sEV具有改善衰老相关细胞损伤的潜力，为抗衰老机制研究提供了新视角。南山小仙的画外音：完好的皮肤屏障功能是保持皮肤健康的最好方法，如果没有健康的皮肤（表皮层），就不用考虑皮肤的年轻态了。而真皮层决定了是否水润、饱满有弹性，是否出现皱纹。
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关于外泌体护肤品的未来思考
随着不断的临床摸索，拥有各种生物学功效的干细胞衍生品的应用价值，从被认识逐渐再到被认可。但是如果应用于护肤品方面，小仙有几个问题提出来供大家思考：不允许。目前干细胞和细胞提取液都不能作为化妆品原料。但不排除以后外泌体标准化规模化制备后，可以作为化妆品新原料。希望各位同仁积极探索（感兴趣的话，大家可留言或私信讨论）。护肤品成分很复杂，包括增稠剂，酸碱调节剂，防腐剂，油脂类，香料，乳化剂、保湿剂等等。如果要用外泌体作为活性成分，就要精简成分，讲究原汁原味，要求外泌体护肤品配伍不能影响外泌体活性。当然护肤品剂型的选择，也很重要。外泌体对温度有严格的要求，-20°C下可储存6个月，-80°C可长期保存。常温下，外泌体里面的活性成分容易降解。然而为了运输和储存方便，外泌体护肤品在常温与低温的保存需要进一步研究探索。目前看来只有冻干粉，凝胶剂冷藏的方式才可在短期内保证其活性（具体剂型大家可留言或私信讨论）4. 如果可以做护肤品，外泌体浓度是不是越高越好？显然不是。这需要进行科学的安全性和有效性评价，选择出一个最佳浓度。这个问题牵扯比较多，涉及工艺开发体系。比如培养体系的影响，比如不同组织来源的影响，比如不同细胞代数的影响，比如生长因子群间的相互影响。这些都是我们亟需探索的方向。显然不能！在皮肤屏障完整的情况下，直接涂抹外泌体很难穿过角质层进入皮肤里的。如何应用，透皮技术就显得尤为重要。让外泌体不破皮进入皮肤是研究者一直感兴趣的研究方向，未来，我们应该研究如何在安全前提下，能够促进有效成分渗透皮肤屏障。[1]Mesenchymal stem cell exosome: a novel stem cell-based therapy for cardiovascular disease. Regen Med. 2011. 6(4): 481-92.
[2]Exosomes derived from human umbilical cord blood mesenchymal stemcells stimulates rejuvenation of human skin. Biochem Biophys Res Commun. 2017.493(2): 1102-1108.
[3]Mechanisms involved in the therapeutic properties of mesenchymal stem cells. Cytokine & Growth Factor Reviews 20 (2009) 419–427
[4]Exosome derivedfrom human umbilical cord mesenchymal stem cell mediates Mi R-181c attenuating burn-induced excessiveinflammation [J]. EBio Medicine, 2016,8:72-82.
[5]Mesenchymal stem cells-derived exosomal micro RNAs contribute towound inflammation [J].Sci China Life Sci, 2016, 59(12): 1305–1312.
[6]. Exosomes released from human induced pluripotentstem cells-derived MSCs facilitate cutaneous wound healing by promotingcollagen synthesis and angiogenesis [J].J Transl Med, 2015,13:49.
[7] Wnt /β-catenin 信号通路在 TGF-β1 诱导的真皮成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转化中作用和机制的研究［D］．西 安: ，2012．
[8].间充质干细胞来源外泌体对免疫功能调控的作用与应用前景[J].中国组织工程研究, 2019, 23(17):2762-2769.
[9]Ultravioletradiation-induced skin aging: the role of DNA damage andoxidative stress in epidermal stem cell damage mediated skin aging [J].StemCells Int, 2016, 2016; 7370642.
[10]外泌体组成特征及其作为细胞通讯和分子标记的生物 学 作 用［J］． 中国生物化学与分子生物学报， 2016，32( 6) : 612-619．
[11] Small Extracellular Vesicles Have GST Activity and Ameliorate Senescence-Related Tissue Damage Cell Metabolism. 2020 Jul7;32(1):71-86.e5.
作者简介：
南山小仙，细胞行业资深从业者。一位致力于细胞临床转化研究，集美貌与智慧于一身的的女子。
谁持彩练当空舞 ：干细胞基础与临床研究进展
相关链接
间充质干细胞治疗（一）：国际视野
间充质干细胞治疗（二）：先进制造工艺
间充质干细胞治疗（三）：质控体系
间充质干细胞治疗（四）：效力评价
简述间充质干细胞药物开发策略，这篇值得一读！
知己知彼：简述制约间充质干细胞药物开发的关键技术
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