科研 | Cell Rep:裂解性KSHV感染人类内皮细胞的定量蛋白组学分析揭示了病毒免疫调节的目标
编译：小友，编辑：Emma、江舜尧。
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在本篇文章中，我们定量分析了7000多种细胞蛋白和71种病毒蛋白，并提供了裂解性KSHV感染过程中蛋白变化的时间概况。裂解性KSHV诱导291种细胞蛋白下调2倍有余，包括双链RNA的关键细胞传感器PKR，尽管每个细胞有多个游离体，但CRISPR-Cas9能有效地靶向KSHV基因组。在一个互补的KSHV全基因组CRISPR基因筛选中我们发现，K5是负责下调两个KSHV靶点Nectin-2和CD155的病毒基因，这两个靶点是NK细胞DNAM-1受体的配体。
论文ID
实验设计
实验结果
1. 内皮细胞中KSHV再激活的蛋白组学兼容系统
为了研究裂解性KSHV感染如何重塑宿主细胞蛋白组，我们需要建立一个兼容蛋白组学方法的KSHV激活系统。他选择研究被KSHV感染的内皮细胞，代表KSHV感染的生理相关体内靶点，最终，他使用了HuAR2T-tert，这是一种在某些条件下人脐静脉内皮细胞衍生的永生细胞系，该细胞系带有编码GFP和RFP的潜在重组KSHV（HuAR2T.rKSHV.219），用来报告病毒的存在（GFP）和再激活（RFP）。通过将外源性KSHV-复制和转录激活因子（RTA）输送到潜伏群体中，KSHV从这些内皮细胞中被重新激活，使用RTA编码杆状病毒和HDAC抑制剂的传统再激活方法很少有超过40％的KSHV裂解感染，这与可靠的蛋白质组数据不符，因为蛋白质组数据需要对85%以上感染的细胞进行分析。为了克服这一限制，我们用表达慢病毒载体（LV）的HuAR2T.rKSHV.219细胞转导了不含HDAC抑制剂的KSHV-RTA（LV RTA）。在RTA转导后（图1A），免疫印迹分析检测到早期（Kb-ZIP）和晚期（K8.1）的裂解性KSHV蛋白，表明从潜伏期到裂解相的重新激活（图1B）。尽管在转导后48 h（hoursposttransduction，hpt）有一定的细胞病变作用，但在65 hpt收获的大多数（大于90％）活化细胞仍保持粘附。为了富集重新激活的细胞，我们对附着的（有活力的）细胞的不同RFP-bright群体（图1C，48和72 hpt）进行了荧光激活细胞进分选（FACS），以获得100％均质的裂解性KSHV群体。
图1 裂解性KSHV诱导内皮细胞蛋白组发生大量变化
（A和B）在指定的时间点（8、25、48和74小时）收获的，用LV RTA转导的HuAR2T.rKSHV.219细胞的免疫印迹分析。（C）对HuAR2T.rKSHV.219细胞进行模拟转导（潜伏）或用LV RTA转导并在指定的时间点（24、48和72小时）收获的流式细胞仪分析。（D）对潜伏期KSHV感染与裂解期KSHV感染的细胞进行定量蛋白组学分析的示意图。用LV RTA或对照LV BFP转导HuAR2T.rKSHV.219细胞，在BFP +或RFP +上分选，并通过质谱（MS）分析。（E）散点图显示潜伏性和裂解性KSHV感染之间的成对比较。每个点代表一个蛋白，用其log2（丰度倍数变化）与该变化的统计显着性（q值）作图。使用Benjamini-Hochberg方法对多个假设检验的值进行了校正。虚线：q ＝ 0.05。（F）未处理或用再活化混合物处理并用所示抗体染色的HuAR2T.rKSHV.219 Cas9细胞的流式细胞术分析。
2. 裂解性KSHV感染诱导内皮细胞蛋白组发生大量变化
通过这个实验，我们获得了KSHV激活细胞的同质群体，并应用了多种基于TMT的蛋白组学来确定在KSHV激活后发生的细胞蛋白组学变化，每个样品重复三次（图1D）。我们量化了7300多个细胞和病毒蛋白，超过1100种细胞蛋白（~15％）被显著上调（q <0.05），包括已知由KSHV vGPCR蛋白诱导的四种宿主基因产物：DUSP5，hIL6，ADAMTS1和PNP，从而验证了我们的方法；超过3000种宿主细胞蛋白（~41％）表现出显著下降，包括先前显示为裂解性KSHV感染耗尽的蛋白：MHC I类，BST2/tetherin，RNA聚合酶II（RNA Pol II）RPB1亚基和NK细胞受体配体ULBP2和CD155（图1E；表S1）；此外，KSHV下调的蛋白包括几个已知的KSHV-K5靶标。我们能够通过流式细胞术确认裂解的KSHV介导的MHC I类，ULBP2和CD155的下调，从而证实了我们的蛋白组学方法（图1F，左栏），还证实了裂解性KSHV的三个靶标的下调—粘附蛋白CD146和CD97以及NK细胞DNAM-1受体的配体Nectin-2（图1F，右栏）。
3. 通过定量蛋白组学分析鉴定病毒蛋白
除宿主细胞蛋白外，我们还定量了71种典型病毒蛋白（大于80％KSHV蛋白组）和两种备用翻译产物KSHV ORF54A和K3A，它们是先前在裂解性KSHV感染的核糖体谱分析中的63种非常规病毒产物中被检测到的（图1E和S1A）。我们还测量了裂解性KSHV感染细胞中的累积蛋白丰度，最丰富的裂解蛋白是ORF25，ORF57，ORF59和ORF6（图S1B），这4种病毒蛋白与200种细胞蛋白一起构成细胞中总蛋白丰度的20％。ORF25，ORF57和ORF59的功能已明确定义：ORF25是一种主要的衣壳蛋白，可拮抗p53介导的细胞凋亡，ORF57是一种有效的转录后KSHV基因表达调控子，ORF59是病毒DNA聚合酶的合成因子，可将病毒DNA聚合酶转运到细胞核中以有效地合成KSHV DNA。ORF6的作用尚不清楚，最近的报道表明，ORF6对于裂解性KSHV复制是必不可少的，与单链DNA（ssDNA）结合，并且可能参与病毒DNA的复制。
4. 带有KSHV全基因组文库的遗传筛选将K5鉴定为负责下调DNAM-1配体的病毒基因
细胞表面蛋白Nectin-2和CD155都是激活DNAM-1的NK细胞受体的配体，并被KSHV下调。我们的蛋白组学实验未鉴定出病毒基因或导致这些细胞蛋白下调的基因。使用KSHV编码基因的CRISPR-Cas9 sgRNA文库的无偏遗传方法提供了一种强大的手段来鉴定负责细胞表型的病毒基因。但是，由于在每个细胞中都有多个游离KSHV的拷贝表达，我们需要确定CRISPR-Cas9是否可以成功靶向病毒基因。将针对ORF45（早期），K5（早期），ORF34（早期）和K8.1（晚期）裂解性KSHV基因的特异性sgRNAs转导至表达CRISPR-Cas9的内皮细胞中，并分析各自病毒基因产物的表达在裂解阶段感染期间（图2A）。ORF45，K5和K8.1基因的蛋白表达被它们各自的sgRNA破坏了（图2A，第6-8条泳道），由于缺乏特异性抗体，无法分析ORF34的表达；由于ORF34对于晚期KSHV基因表达必不可少，K8.1表达的破坏（图2A，第5行）可以作为ORF34成功缺失的代表；早期Kb-ZIP蛋白的水平在所有样品中均不受影响。在确认CRISPR-Cas9特异性并有效地敲除病毒基因组中的裂解基因后，我们设计了一个针对143个KSHV基因和12个miRNA的KSHV全基因组sgRNA文库，每个基因最多10个sgRNA，用于将细胞表型与负责的病毒连接一个或多个基因（表S2），文库用于筛选KSHV编码的基因或靶向Nectin-2和CD155降解的基因。我们用合并的sgRNA文库转导潜伏的HuAR2T.rKSHV.219 Cas9细胞，以单独消耗病毒ORF和miRNA（图2B）。在RTA慢病毒激活裂解KSHV后，我们使用流式细胞术(FACS)来富集那些不能下调Nectin-2和CD155的稀有裂解细胞，对这个富集群体中整合的sgRNAs进行测序，发现K5是负责下调Nectin-2和CD155的单一病毒ORF（图2C和2D）。随后的流式细胞仪分析证实，K5特异性sgRNA完全（Nectin-2）或部分（CD155）通过裂解性KSHV挽救了这些配体的下调（图2E），用慢病毒表达K5会降低两种受体的细胞表面表达（图2F）。我们得出的结论是，KSHV编码基因的CRISPR-Cas9 sgRNA文库是鉴定负责细胞表型的病毒基因的有效方法，并且K5对于下调DNAM-1配体Nectin-2和CD155既必要又充分。
图2 KSHV CRISPR库筛选发现K5是负责下调NK细胞受体配体Nectin-2和CD155的ORF
（A）HuAR2T.rKSHV.219Cas9细胞的免疫印迹分析，这些sgRNAs可用于未处理或经再激活混合液处理的病毒ORFs，并用所示抗体探测。非特定的带用星号标记。（B）具有KSHVCRISPR文库的遗传筛选的示意流程图。用sgRNA文库转导HuAR2T.rKSHV.219Cas9细胞，然后进行裂解性KSHV循环诱导，并用CD155-或Nectin-2-特异性抗体染色。通过FACS选择Lytic（RFP +）和CD155-或Nectin-2-high细胞，并将其用于DNA提取和测序。（C和D）使用KSHV CRISPR库进行的遗传筛选将K5鉴定为ORF，其负责Nectin-2和CD155的下调。每个点代表单个shRNA富集的统计学显著性（-log p值）绘制的KSHV ORF或miRNA。（E）CRISPR介导的K5敲除导致完全（Nectin-2）或部分（CD155）裂解性KSHV诱导的细胞表面蛋白下调HuAR2T.rKSHV.219 Cas9细胞的流式细胞术分析，具有对照、未处理的K5特异性sgRNA或未用再活化混合物处理并用所示抗体染色的K5特异性sgRNA。（F）用LVK5或对照LV转导并用所示抗体探测的HuAR2T细胞的流式细胞术分析。
5. CRISPR-Cas9修饰的病毒基因组的蛋白组学分析确定了内皮细胞中KSHV K5的靶标
K5是有效的KSHV编码的E3连接酶，具有广泛的靶标特异性，K5是导致Nectin-2和CD155下调的病毒基因产物。我们推测内皮细胞中可能还有其他K5底物，并着手分析K5在裂解性KSHV感染中如何影响宿主细胞蛋白组，我们想比较感染野生型（WT）和K5缺陷型KSHV的内皮细胞，其中使用CRISPR-Cas9敲除K5。从CRISPR KSHV文库中鉴定出三个K5特异性sgRNA，可有效挽救ICAM-1的下调，ICAM-1是特征明确的K5靶标（图S2A）。HuAR2T.rKSHV.219 Cas9细胞的K5抗体特异性免疫印迹分析证实，携带K5特异性sgRNA的样品中K5缺失，但未检测到对照（β2-微球蛋白[β2m]）sgRNA（图S2B）。K5的这种有效消耗使我们能够进行差异蛋白组学分析，将WT KSHV感染的细胞与CRISPR K5敲除KSHV感染的细胞进行比较，使用实验设置（图3A），我们在HuAR2T.rKSHV.219 Cas9细胞中进行了9-plex TMT蛋白组学研究，并比较了以下内容：（1）KSHV潜伏细胞，（2）用对照sgRNA转导的KSHV裂解细胞，和（3）用两种K5特异性sgRNA组合转导的KSHV裂解细胞。每批重复三次。我们在三组中鉴定了8238个宿主细胞蛋白，而k5是唯一与该病毒群相匹配的病毒蛋白，证实了KSHV基因定位的特异性并验证了我们的方法（图3C）。与CRISPR K5病毒相比（通过蓝点表示），有48个宿主蛋白被对照裂解性KSHV感染显著下调（q <0.1）（图3C-3E；表S3），48种蛋白中的41种位于291种细胞底物中，这些底物因对照裂解性KSHV感染而下调2倍以上。先前报道了48种蛋白中有30种是K5底物，包括特征明确的靶标，例如I类MHC，ICAM-1，PECAM，ALCAM，BST2 /tetherin，HFE和最近的蛋白组学研究中的K5靶标，是Ephrin和Plexin受体家族的成员；有18种K5底物以前没有报道过，除Nectin-2和CD155外，质膜蛋白还包括受体酪氨酸激酶（DDR2，ROR2和Erbb2），受体型酪氨酸蛋白磷酸酶（PTPRJ和PTPRE），细胞因子和生长因子受体（IL10RB，TRAIL-R2）和IGF2R），锌转运蛋白SLC39A3，粘附分子CD146，表面透明质酸酶TMEM2和PD-L2（PD-1受体的配体）。通过流式细胞仪分析，我们证实了这些细胞表面靶标中的4个（Erbb2，CD146，PD-L2和TRAIL-R2）的K5依赖性下调（图3F），EphA2特别重要，因为它是KSHV的细胞表面进入受体，并且通过免疫印迹（图3G）和流式细胞术（图S2C）证实了K5对其下调。其他K5底物包括SNARE蛋白家族的三个成员（STX7，STX12和VAMP8），其中两个在用K5慢病毒转导的HuAR2T细胞中得到了验证（图3H和S2D）。这些结果证明了CRISPR-Cas9系统在有效产生病毒基因敲除中的效用，尽管每个感染细胞中存在多个附加的KSHV基因组拷贝，以上实验还强调了K5在裂解性KSHV感染期间宿主细胞蛋白质组重构中的关键作用。
图3 CRISPR蛋白组学鉴定出内皮细胞中的48个KSHV K5目标
（A）裂解性与潜伏性KSHV感染细胞定量蛋白组学分析的示意图。将带有对照或K5特异性sgRNA的HuAR2T.rKSHV.219 Cas9细胞用LV RTA或对照LV BFP转导，在BFP+或RFP +上分选，并通过MS进行分析。（B）KSHVK5蛋白显著（q <0.1）下调了内皮细胞中的48种蛋白，其中30种是已知的K5靶标（蓝色圆圈的左侧），18种蛋白代表了本研究中鉴定的K5靶标（黄色圆圈）。（C–E）散点图显示了裂解对照和CRISPR K5（C）潜伏和裂解对照（D）以及潜伏和裂解CRISPR K5（E）KSHV感染的成对比较。每个点代表一个蛋白，用其log2（丰度倍数变化）与该变化的统计显著性（p和q值）作图。使用Benjamini-Hochberg方法对多个假设检验的值进行了校正。虚线：q ＝ 0.05。（F）用LVK5或对照LV转导并用同种型对照抗体或对所示蛋白特异的抗体染色的HuAR2T细胞的流式细胞术分析。（G和H）用LV K5或对照LV转导，在GFP +上分类并用所示抗体探测的HuAR2T细胞的免疫印迹分析。
6. 早期裂解性KSHV因子可耗尽PKR
KSHV的主要裂解目标是PKR。PKR与蛋白激酶C（PKC）相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PKN1和PKN2一起，以不依赖K5的方式下调（图3D和3E），PKR是重要的宿主抗病毒蛋白，其裂解性KSHV的下调可能代表了病毒激活的关键步骤，与RFP阴性（潜伏）HuAR2T.rKSHV.219细胞相比，流式细胞术验证了RFP阳性（KSHV裂解）细胞群中PKR水平的降低（图4A）。接下来，我们通过免疫印迹分析评估了LV RTA或对照LV BFP转导的HuAR2T.rKSHV.219细胞筛选群体中的PKR水平（图4B）。我们的数据证实，与未感染或潜伏感染的细胞相比，在RTA转导后48或60小时，KSHV激活的RFP+群体的PKR显着减少。此外，异位血凝素（HA）标记的PKR（不是GFP对照），被裂解性KSHV下调（图4C），表明该作用既是特异性的，又是启动子无关的。膦乙酸（PAA）是一种病毒DNA聚合酶抑制剂，可阻止晚期基因表达，PAA处理裂解（RFP +）细胞不会影响PKR的耗竭，但会阻止晚期K8.1A/B蛋白的表达（图4D），表明PKR的下调是早期裂解情况。qRT-PCR分析比较了来自RFP +分选的（裂解）细胞和对照（潜伏）细胞的mRNA，表明裂解的KSHV使PKR基因表达降低4.7倍（log2等级为2.2倍）（图4E）。我们还观察到LIMD1（SO2核酸内切酶的靶标）的下调（在log2范围上为7.1倍或2.8倍），总的来说，这些结果表明KSHV感染以PKR启动子非依赖性的方式导致PKR的转录下调，这是由早期的裂解性病毒因子引起的，尽管我们不能排除裂解性感染中PKR受基因表达关闭的影响的可能性，但我们发现当单独表达时，病毒SOX蛋白不会影响PKR蛋白水平（图S3A）。除SOX以外，我们还测试了几种早期裂解性病毒ORF的PKR消耗，包括ORF57，据报道其干扰PKR功能（数据未显示；图S3B），我们还发现，在KSHV重新激活时，poly（I：C）诱导的eIF2α磷酸化（一种下游PKR信号的量度）受损（图4F ）。
图4 溶蛋白KSHV感染下调蛋白激酶R
（A）具有潜伏性（上图）和裂解性（下图）KSHV感染的HuAR2T.rKSHV.219细胞的流式细胞仪分析。（B）在KSHV潜伏和裂解阶段未感染的HuAR2T细胞（泳道1）和HuAR2T.rKSHV.219细胞（泳道2-5）的免疫印迹分析。（C）未经处理或未用再活化混合物处理并用抗HA标签抗体染色的PKR-4xHA和GFP-HA稳定表达的HuAR2T.rKSHV.219细胞的流式细胞术分析。来自HA标签的信号在RFP +群体（红线）和潜伏细胞（黑线）之间进行比较。（D）用LVRTA或对照LV转导，在RFP +上分选并用所示抗体探测的HuAR2T.rKSHV.219细胞的免疫印迹分析。（E）qRT-PCR分析宿主细胞和病毒基因的表达，包括裂解阶段和潜伏阶段。数据表示为平均值±SEM。（F）用RTA活化混合物和poly（I：C）处理的HuAR2T.rKSHV.219 Cas9细胞的免疫印迹分析，并用所示抗体探测。
7. 内皮细胞裂解性KSHV再激活导致的蛋白和通路失调
两个独立的蛋白组学实验的成对比较（来自图1D和3A）表明，蛋白丰度的变化在两个数据集之间具有很好的相关性（图S4）。为了进一步了解KSHV诱导的宿主细胞蛋白组的变化，我们使用DAVID平台对蛋白组学数据集进行了基因本体（GO）分析（表S4），在上调的蛋白中，与mRNA处理、翻译、折叠和蛋白运输所需的宿主细胞机制相关的GO term明显富集。最富集的类别与蛋白折叠有关，主要是两个家族的成员：（1）热激蛋白70（HSP70）和（2）伴侣蛋白无尾复合多肽1（TCP1）环复合物（TRiC）的所有八个亚基（图5B），两个家族均代表癌症治疗的治疗靶点。Poly（A）RNA结合是上调蛋白中最丰富的一类（74种蛋白）（图5C），据报道该组的许多成员与病毒mRNA加工的关键参与者KSHV ORF57相关（表1）。裂解性KSHV下调的蛋白中的GO term特别富集在表面受体、蛋白激酶以及相关的生物过程中，如细胞粘附和信号转导等方面。尽管这些蛋白中有许多代表K5靶标（图3C-3E），但许多变化似乎与K5无关，并且裂解期KSHV感染很容易通过流式细胞仪证实三种表面蛋白（EphA2，ITGA6和UFO激酶）的下调（图5E和5F）。除了PKR（图4A和4B）之外，在“蛋白激酶活性”类别（图5G）中，我们还验证了PKN2激酶的消耗（图5H）与“染色质结合”相关蛋白的富集（图5I）。该组中的几种蛋白调节裂解性病毒基因的表达，例如HDAC和Rad21，以及核因子κB（NF-κB）信号通路，例如RelB和Ajuba蛋白，在从潜伏期到裂解阶段KSHV感染的转变中起重要作用。通过免疫印迹分析筛选的裂解细胞(RFP+)与潜在对照细胞(BFP+)，证实了裂解性KSHV介导的Ajuba耗竭（图5J）。总的来说，这些结果强调了裂解性KSHV感染下调的宿主蛋白范围，尽管病毒使用的宿主细胞机制被上调，但细胞表面蛋白，激酶和染色质结合蛋白的表达主要被下调。
图5 Lytic KSHV感染失调的蛋白的DAVID GO term分析
（A）在裂解性KSHV上调的蛋白中，按“分子功能”类别的统计显着性（p值）排列的十个最丰富的GO term。（B）直方图显示了GO term“未折叠的蛋白结合”中蛋白丰度的倍数变化。（C）在散点图上突出显示了GO term“ poly（A）RNA结合”中上调的蛋白（红点），该图显示了潜伏性和裂解性KSHV感染之间的成对比较。每个点代表一个蛋白，用其log2（丰度倍数变化）与该变化的统计显著性（q值）作图。使用Benjamini-Hochberg方法对多个假设检验的值进行了校正。虚线：q =0.05（D）在裂解KSHV下调的蛋白中，按“分子功能”类别的统计显著性（p值）排列的十个最丰富的GO term。（E）从GOterm“整联蛋白结合”和“跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性”的角度出发，验证裂解性KSHV介导的表面蛋白下调。（F）潜伏（灰色），裂解性CRISPR对照（蓝色）和裂解性CRISPR K5（绿色）KSHV感染细胞中所示宿主蛋白的相对丰度。蛋白丰度计算为最大TMT报告离子强度的分数。数据表示为平均值±SEM。（G–J）在散点图上突出显示了GO项“蛋白激酶活性”（G）和“染色质结合”（I）下调的蛋白，这些散点图显示了潜伏性和裂解性KSHV感染之间的成对比较。每个点代表一个蛋白，用其log2（丰度倍数变化）与该变化的统计显着性（q值）作图。使用Benjamini-Hochberg方法对多个假设检验的值进行了校正。虚线：q ＝ 0.05。（H和J）用LV RTA或对照LV BFP转导，在BFP+或RFP +上分类并用所示抗体探测的HuAR2T.rKSHV.219细胞的免疫印迹分析。非特异性条带标有星号。
表1 与KSHVORF57功能相关的上调蛋白
8. KSHV ORFs的动力学分析显示病毒蛋白的表达取决于病毒DNA聚合酶的活性
为了剖析KSHV激活后病毒和宿主蛋白丰度的时间变化，我们在HuAR2T.rKSHV.219Cas9细胞从潜伏性感染变为溶菌性感染后三个时间点（36、48和60 h）进行了蛋白组学分析（图6A），每个时间点的可靠的蛋白质组数据分析需要流式细胞仪来培养>85%的溶解感染(RFP+)细胞的同质群体，在激活后的36小时之前获得同源的裂解RFP+细胞理论上是可取的，但在技术上不可行。为了区分由早期和晚期病毒蛋白介导的宿主细胞蛋白组的变化，我们计入了在病毒DNA复制抑制剂PAA存在下（在48和60 h时间点）进行KSHV激活的样品。我们首先试图确定病毒ORF的表达动力学，并对蛋白组学实验3中量化的所有KSHV蛋白进行了蛋白组学实验，我们生成了62个KSHV ORF的时间和PAA敏感性图（图6B），并鉴定了5个病毒蛋白簇。簇1和2总共包含30种蛋白，它们在重新激活后从36小时增加到60小时，并且对PAA不敏感（图6C）或仅中等敏感（图6D），先前已经报道了来自这些簇的蛋白表现出立即早期表达动力学，例如ORF45或K8，或早期表达动力学例如ORF61，K5或ORF66；簇3中的15种蛋白也从36小时增加到60小时，但对PAA的敏感性比簇2中的蛋白更高（图6E）；簇4具有在36小时强烈诱导的4种蛋白，并且显示出对PAA处理的中等敏感性（图6F），有趣的是，先前报道了来自该簇的两种裂解病毒基因产物ORF37和ORF49具有早期动力学；簇5包含12种蛋白，其表达在以后的感染（48-72小时）中增加，并且对PAA敏感（图6G）。先前报道了来自簇3和簇5的许多蛋白的表达取决于病毒DNA聚合酶活性并表现出后期表达动力学，这些蛋白主要是KSHV病毒体的结构成分，例如衣壳蛋白ORF17，ORF25，ORF26，ORF62和ORF65；包膜糖蛋白gB（ORF8），gH（ORF22），ORF39（gM），K8.1和ORF28;以及已知或预测的外皮蛋白ORF75，ORF64，ORF52和ORF42。除结构蛋白外，第5组中对PAA高度敏感的KSHV基因产物还包括推定的门户蛋白ORF43和ORF20（一种裂解蛋白，可通过与寡聚腺苷酸合成酶样蛋白（OASL）相互作用来促进KSHV感染）。先前已经显示两种ORF的表达对病毒DNA聚合酶活性的抑制敏感，因此，我们的结果证实了这些发现。显示了蛋白组学实验中定量的所有宿主细胞蛋白的层次聚类分析，具有超过8000种宿主细胞蛋白的时间和PAA依赖性概况（图S6A），其中包括下调的细胞蛋白，例如PKR和PD-L2（图S6B），或病毒重新激活后上调的蛋白，例如ADAMTS1和TPRC4（图S6C）。因此，我们提供了从潜伏期到裂解期感染重新激活后KSHV和宿主细胞蛋白表达的独特时程，并鉴定了其表达取决于病毒DNA聚合酶活性的病毒ORF。
图6. KSHV蛋白的动力学分析
（A）在KSHV重新激活后36、48和60 h对潜伏感染与溶菌感染的细胞进行蛋白组学分析的示意图。（B）定量分析所有病毒蛋白的层次聚类分析。热图显示了62个KSHV ORF的时间和PAA敏感性曲线。行和列分别代表单独的病毒ORF和实验样品。（C–G）簇1–5中病毒蛋白的平均时间和PAA敏感性分布。蛋白丰度计算为最大TMT报告离子强度的分数。
9. 用裂解CRISPRORF57敲低突变体的细胞进行的蛋白组学分析揭示了需要有效表达需要ORF57的KSHV ORF的子集
ORF57是一种多功能KSHV蛋白，已知可稳定病毒转录本，促进核输出并增强几种裂解性病毒基因产物的翻译。尽管之前有几项研究专注于鉴定表达依赖于ORF57的KSHV转录物和蛋白，但需要ORF57才能有效表达的KSHV蛋白的完整集合仍然未知。为了产生KSHV CRISPR ORF57突变体，我们用对照或ORF57特异性sgRNA转导了HuAR2T.rKSHV.219Cas9细胞，并通过免疫印迹分析了KSHV激活后的ORF57敲低情况。用ORF57特异性抗体进行的免疫印迹分析显示，在裂解性KSHV感染的内皮细胞中，CRISPR-Cas9介导的ORF57的有效缺失（图S7A）。为了比较由裂解CRISPR ORF57和WT KSHV感染引起的变化，我们在蛋白组学实验3中包括了具有裂解KSHV CRISPR ORF57突变体感染的细胞样本，以及具有控制性裂解KSHV感染的细胞，在蛋白组学实验中进行了分析，图3证实了由CRISPR-Cas9介导的ORF57的有效缺失（图S7B）。为了鉴定需要ORF57才能有效表达的病毒ORF，我们对裂解对照与CRISPR ORF57感染（图S7C）进行了病毒ORF相对蛋白丰度的分层聚类分析，我们观察到三类病毒蛋白，其中（1）KSHV ORF的表达受到ORF57敲除的强烈抑制，（2）表达受到ORF57敲除的中度抑制，（3）表达不依赖于ORF57敲除，或通过ORF57敲除而增强。因此，我们关于需要ORF57才能有效表达KSHV基因产物的数据证实了先前研究的结果，并扩展了依赖ORF57病毒基因产物的列表。
讨论
在这项研究中，我们建立了蛋白组学兼容系统，以研究潜伏感染的人内皮细胞中KSHV的重新激活，这使我们能够确定裂解期KSHV感染如何改变病毒和宿主细胞蛋白组。我们提供了一个易于搜索的交互式数据表（表S1），全面描述了裂解期KSHV感染期间>7000种病毒和细胞蛋白的变化，我们的数据表明，KSHV利用转录和转录后机制重塑其宿主细胞，上调与mRNA生物发生和蛋白产生有关的细胞蛋白，并下调细胞表面受体，粘附分子，蛋白激酶和染色质结合蛋白。尽管每个细胞有多个KSHV附加体，但我们发现CRISPR-Cas9是产生裂解性KSHV基因病毒敲除的有效机制，通过生成1281个KSHV编码的sgRNA的CRISPR文库，我们进行了KSHV全基因组遗传筛选，确定了K5为负责下调细胞KSHV靶标的病毒基因，这是激活DNAM-1的NK细胞受体的两个配体。尽管K5作为下调宿主细胞蛋白的主要KSHV编码病毒基因而出现，但抗病毒蛋白PKR是以不依赖K5的方式下调的最高命中之一，PKR被早期裂解性病毒因子耗尽，其动力学类似于对eIF2α磷酸化的抑制，这表明PKR耗尽可能有助于抑制裂解性KSHV感染介导的翻译关闭。
以前，裂解性KSHV诱导的宿主细胞变化在mRNA水平上进行了分析，并揭示了宿主基因表达的整体抑制作用，这归因于病毒SOX蛋白（ORF37）（Chandriani和Ganem，2007; Glaunsinger和Ganem，2004a，2004b）。大多数（~95％）宿主转录物被下调，而在溶菌感染中只有一小部分（~2％）被上调。目前尚不清楚该基因表达的关闭如何与蛋白组的变化相关。，在这里，我们报告了裂解KSHV诱导的内皮细胞蛋白组变化的首次综合研究。我们发现，裂解性KSHV显着（q <0.05）下调了约41％的宿主细胞蛋白，令人惊讶的是，约有15％的宿主细胞蛋白被裂解感染显着上调，这种差异可能反映了转录组学和蛋白组学数据之间的相关性较差，因为涉及其他因素，例如mRNA翻译效率和蛋白稳定性。
我们对由KSHV激活诱导的蛋白的分析确定了参与mRNA加工，翻译和蛋白折叠的宿主细胞成分的富集。这并不出乎意料，因为在没有为这些过程编码其自身基因的情况下，KSHV必须使用合适的宿主细胞机制才能成功复制病毒。在上调的mRNA结合蛋白中，有几个已知的KSHV ORF57相互作用伙伴，这与以前的报道一致，表明该蛋白在KSHV RNA的加工中起着核心作用，起始因子的上调支持先前关于通过裂解KSHV调节翻译机制的发现。KSHV诱导Hsp70和TRiC复杂家族的成分的发现很重要，因为它们可能代表治疗靶点，尽管尚不清楚它们在裂解性KSHV感染中的作用，但两个Hsp70亚型对于裂解性KSHV感染至关重要。
基于CRISPR的遗传学和随后的蛋白组学相结合，使我们能够鉴定出受KSHVK5基因产物调控的内皮细胞蛋白。使用基于TMT的蛋白组学将WTKSHV与CRISPR介导的K5缺陷型KSHV进行比较，我们确定了K5的内皮细胞靶标，先前的两项研究报道了在HeLa和KBM7细胞中异位K5表达后下调的细胞靶标。我们用目前的方法在生理相关的内皮细胞中鉴定了48个K5靶标，与异位K5病毒基因表达相反，它具有在KSHV感染情况下进行的额外优势。一个有趣的发现是Nectin-2和CD155（活化DNAM-1的NK细胞受体的配体）的K5依赖性下调，尽管已知CD155会因病毒激活而下调，但这是Nectin-2被裂解性KSHV耗尽的第一份报道。K5通过消耗ICAM-1，NKG2D配体MICA和MICB以及NKp80配体AICL来保护感染病毒的细胞免于NK细胞裂解，先前已证明HCMV编码的UL141蛋白对DNAM-1介导的NK细胞对疱疹病毒感染的控制作用。涉及NK细胞应答的另一种内皮细胞K5靶标是TRAIL-R2，它是TNFSF10/ TRAIL配体的受体，TRAIL由包括NK细胞在内的许多免疫细胞分泌，导致靶细胞被杀死。有趣的是，TRAIL-R2与Nectin-2和CD155一起被HCMV UL141蛋白下调，以保护HCMV感染的细胞免于TRAIL介导的NK细胞裂解。总而言之，这些发现扩展了KSHV靶向的免疫受体的范围，并强调了K5在逃避宿主细胞免疫反应的KSHV中的核心作用。K5对EphA2的消耗特别重要，因为它是KSHV的进入受体，几种病毒下调其进入受体，以防止双重感染并使病毒释放。该策略对于KSHV可能特别重要，因为其gL / gH糖蛋白包膜复合物对EphA2受体具有高度亲和力，EphA2的丢失将使KSHV出口期间高尔基体来源的囊泡能够有效释放病毒体，其方式类似于报道的另一个K5靶标tetherin。
除免疫受体外，K5还靶向蛋白，这些蛋白的下调具有不太明显的功能后果。先前的报告确定了SNARE家族成员STX4的K5介导的耗竭，现在我们将其他SNARE成员STX7，STX12和VAMP8识别为K5靶标。尽管尚不清楚它们被K5耗尽的原因，但SNARE家族的许多成员都参与了细胞因子和肿瘤坏死因子TNF-α分泌（STX7）。KSHVK5介导的STX7下调可能抑制细胞因子的释放，因为TNF-α抑制了内皮细胞中KSHV基因的转录。
一个有趣的发现是，裂解性KSHV感染耗尽了PKR的宿主内皮细胞。尽管所有疱疹病毒科成员都干扰PKR功能，但没有证据表明它们会耗尽PKR细胞。据报道，KSHV ORF57与PKR相互作用并抑制dsRNA结合和PKR自磷酸化，从而导致eIF2α磷酸化受到抑制，我们的结果表明，PKR的耗竭也必须有助于KSHV介导的裂解性翻译阻断。一个悬而未决的问题是，哪个或哪些病毒基因下调了PKR？它的耗竭对PAA不敏感，表明它参与了早期的病毒功能。我们尝试使用单个早期病毒ORF cDNA或KSHV CRISPR文库筛选PKR耗竭的尝试未能鉴定出显着性命中（数据未显示），表明PKR可能是一种以上病毒因子的靶标。我们两个独立的蛋白组学实验的结果表明，在蛋白水平上，裂解性KSHV的重新激活导致PKR的下调3.5倍和5.3倍。这与qPCR分析相当，后者显示裂解性KSHV感染将PKR mRNA下调4.7倍，但是仍有待确定，降低的PKR转录是否是在蛋白水平上观察到的PKR消耗的唯一因素。PKR的转录下调，以及其消耗是独立于启动子的观察，表明PKR可能被KSHV编码的miRNA靶向，但是，大多数KSHV mRNA的表达在裂解期KSHV感染中并未增强，而Drosha的活性在裂解期KSHV感染中受到抑制，这使得这种可能性降低。ORF37（SOX）介导的宿主基因表达的关闭可能有助于PKR抑制，但不是唯一的影响因素，SOX的分离表达不影响PKR蛋白水平，表明涉及其他病毒基因。
我们的蛋白组学分析确定了71种典型的病毒蛋白（> 80％的KSHV蛋白组），但只有两种替代翻译产物（KSHV ORF54A和K3A），而溶核性KSHV感染的核糖体分析报告了63种替代翻译病毒产物。大多数非经典产物均来自替代起始密码子，而不是代表新的ORF，这使其与典型ORF的区分具有挑战性，并取决于在翻译起始位点检测到的少量独特肽。
我们在病毒重新激活后表达蛋白的时间过程已确定了62种KSHV蛋白，包括其表达取决于病毒DNA聚合酶和ORF57蛋白的那些病毒蛋白，以及8000多种内皮宿主细胞蛋白，先前曾在B细胞和内皮细胞中报道过溶菌性KSHV感染的转录动力学分析，但这是第一个蛋白组动力学裂解性KSHV感染分析。此外，PAA处理使我们能够区分其表达取决于病毒DNA聚合酶活性的KSHV蛋白，12/62蛋白（约19％）的表达对PAA高度敏感，33种蛋白（约53％）表现出中等的PAA敏感性，17种蛋白（约27％）对PAA不敏感。这些结果与西多福韦对KSHV ORF表达的基于微阵列的分析有关。据报道，显示早期mRNA动力学的裂解基因产物（ORF37和ORF49）在蛋白水平上对PAA敏感。我们可以通过独特的转录后调节来解释这种差异，即由对PAA介导的病毒DNA聚合酶阻滞敏感的机制介导。
总而言之，我们发现了裂解期KSHV感染如何重塑宿主细胞蛋白组。我们的结果突出了病毒在重新激活过程中调节的关键宿主细胞过程，并扩展了作者对KSHV如何抵消宿主固有免疫反应的见解。我们的数据还提供了两个重要资源：（1）内皮细胞中裂解性KSHV如何影响宿主细胞蛋白的信息，以及（2）整组KSHV编码的ORF和miRNA特异的sgRNA文库序列，以产生CRISPR敲除KSHV突变体。将需要进一步的工作来鉴定引起本研究中鉴定的宿主蛋白失调的病毒因子，并阐明其在KSHV发病机理中的作用。
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211124720312389#!