科研 | PNAS：基于Connect-Seq分子叠加构建的神经回路图

编译：姜意达，编辑：十九、江舜尧。

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导读

老鼠大脑里大约包含7500万个神经元且互相连接在大量的神经回路（neuron circuits）中，但是有相当一部分的单个神经元的组成与功能都尚未清楚。为了更好的探究在特定的神经回路中所特有的分子特性与含有通讯功能的信号通路，研究人员提出Connect-seq技术。这一新方法，结合了逆转录病毒的路线与单细胞组学，生成了神经回路中的分子图，这种图可以与神经解剖循环（anatomical circuit）图谱叠加，融合分子与基因，更好的展示了神经回路中各个神经元的功能。该方法应用于下丘脑神经元控制的生理反应中，揭示了上游基因的不同信号表达，可作为区分其解剖位置的重要依据。Connect-seq 可在现有的解剖神经回路图谱上构建相对应的分子映射图谱。

论文ID

原名：Connect-seq to superimpose molecular on anatomical neural circuit maps

译名：基于Connect-Seq分子叠加构建的神经回路图

期刊：PNAS

IF: 9.73

发表时间：2020.02.7

通讯作者：Linda B. Buck

通讯作者单位:美国西雅图华盛顿大学基因组研究学院与癌症研究所

DOI号：www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1912176117

实验设计

图1：Connect-Seq 方法步骤：(A)PRVB180 的表达由Cre重组酶与产生绿色荧光的胸腺素酶（thymidine kinase）的上互相融合构建而成（TK-GFP）。(B) 在激素内的PRVB180与促皮层素释放激素(CRHNs, corticotropin-releasing hormone neurons)一同被注释进CRH-Cre小鼠的脑（PVN）中。(C) 与此同时PRVB180大量复制并到达上游神经元，研究人员从下丘脑（PVN）中分离并得到单个细胞后进行流式细胞分选，筛选出带有大量荧光（FITC-A）且含有微量DAPI-A染色的细胞，筛选出的单细胞置于多孔板；最后，通过scRNA-Seq来分析其转录因子与神经递质因子的表达水平，最终确定含有PRV 阳性表达的上游信号位置，从而在现有的解剖循环图谱上叠加构建相对应的分子图谱。

结果

1 促皮层素释放激素(CRHN)神经元上游的转录水平分析

通过将CRHNs 病毒注入进CRH-Cre小鼠脑(PVN)后，在神经元中对上游神经元进行转录水平分析并对细胞进行标记，发现神经元中的表达基因与基因数量没有相关性，但PRV的感染可缩小检测范围。

2 神经元上游CRHNs的多样化神经递质（Neurotransmitters）与神经调节剂器（Neuromodulators）

在图2中，研究者发现了由PRV感染的神经元上游出现了大量的不同种类的神经递质（Neurotransmitters）与神经调节剂器（Neuromodulators）。信号包括作用于离子通道（ligand-gate）的GABA 和谷氨酸,为主要的大脑兴奋和抑制性神经递质，并作为神经调节器与下游神经元上特定的GPCR 蛋白结合。如图2A所示，65% 的神经递质处于神经元的上游。研究发现，谷氨酸前突（presynaptic）神经元可激活CRHN，但是还有许多上游神经元可通过GABA抑制CRHN的活性。研究者发现，通过在CRHN的上游识别不同生物表达胺的神经元功能，可以确定胺如何影响其表达。从此结果可得出，神经肽可通过与下游神经元上的GPCR结合来充当神经调节剂，以增强或减弱神经元的兴奋程度。上游神经元中的差异性表达数据可为解析CRHN上游的叠加式的（superimposing）分子结构图提供了丰富的证据支持，并将会用于剖析上游神经元中不同子集的功能。

图2 ：CRHN上游的神经元表达出大量的分子信号（A）饼图显示上游神经元的不同表达百分比包括神经递质，生物胺（biogenic amines）, 神经肽（neuropeptides）, 神经调节剂和其他调节剂 （B）热图展示了在117个上游神经元中的不同表达水平。X轴为117个神经元，Y轴为基因包括信号基因，神经元标记基因，标准基因（housekeeping genes）和编码（encoding）与指示基因。

3 多种信号分子表达于上游神经元中

所有神经元均表达了至少一种分子信号，图3A与B所示，有86.3％的神经元有两个或多个表达分子信号。许多上游神经元在特定的神经肽与谷氨酸（或GABA）共表达（图2B和3C），有些神经元则出现神经肽，谷氨酸与GABA共同共同表达的情况（图2B和3D）。在实验中，研究者发现有7个神经元中都表达Cck(胆囊收缩素)，两个同时表达谷氨酸与GABA，另有17个神经元均出现Tac1 （tachykinin1）。如图3C所示，许多神经肽可以在某些上游神经元中与谷氨酸或GBAB共表达。其中，有9个与谷氨酸共表达和GABA在同一神经元中。这些结果增加了单个神经肽的可能性，说明了调节CRHN 取决于神经肽是否与谷氨酸或GABA结合。

图3：在神经元上游的不同信号通路组合 （A与B）通过数字（A）与百分比（B）展示了不同数量的上游神经元与神经调节剂。（C与D）显示了与神经肽共表达的谷氨酸与抑制神经递质的GABA或甘氨酸或乙酰胆碱（C）或神经调节生物胺(neuromodulatory biogenic amines)。

4 多种神经肽在上游神经元的过表达

图4 A与B所示，6.8％的细胞共表达五个或六个神经肽。由此可得，单个神经元中可出现多个共表达神经肽，这些结果与以前的报道一致：即神经元除了有特定的神经肽之外也可以表达其他神经肽。此外，作者比较了通过Connect-seq分离的PRV⁺Pomc⁺神经元与手动从Pomc-eGFP小鼠中分离的未感染Pomc⁺神经元的RNA-seq数据发现，单个Pomc⁺神经元与Pomc共表达一种或多种神经肽（图4C）。但是，在同一神经元中两种神经肽的高水平表达相对较少。例如，Penk（原脑啡肽）与其他12种神经肽共表达，但在高水平表达Penk的神经元中仅检测到两种神经肽的水平 ≥1,000 FPKM（图4C）。

为了进一步研究单个神经元中神经肽的共表达，作者比较了单个神经元中不同神经肽的表达水平（图5）, 在单个神经元的水平上, 少数神经元以相似的水平表达存在于两个或三个神经肽中。本文作者提出一个问题，是否可以根据生理状态的差异而改变神经元中不同信号分子的表达水平。

图4：在上游神经元中的多种神经肽共表达 （A和B）上游神经元的数量（A）和百分比（B）, （C）显示在单个神经元中特定神经肽的共表达。 在X和Y轴：上游神经元中检测到的神经肽。 彩色框表示在至少一个神经元中以1至99 FPKM（蓝色），100至999 FPKM（紫色）或 ≥1,000FPKM（红色）共表达的神经肽对。

图5：神经肽在单个神经元的共表达 在单个神经元中不同神经肽的表达水平各不相同。 细胞根据它们表达的神经肽的数量排列在X轴上（1-8）。Y轴表示每个细胞中神经肽的表达水平（FPKM），不同的神经肽以不同的颜色表示。

5 特定上游神经元映射至大脑指定区域

此次研究目的是找到一种方法来揭示上游神经元的分子标识，从而使分子图叠加在CRHNs上游神经元的解剖图上。对此，作者分析了上游神经元的位置。首先用PRVB177感染CRHN，PRVB177具有Cre依赖性表达的血凝素（HA-标记）TK；3天后，当病毒越过一个突触立即感染上游的神经元时，采用特定神经调节剂和HA抗体，检测PRV感染的神经元中神经调节剂的表达水平（图6）。如图6 A与B 所示，在五个脑区域（包括下丘脑的四个区域）的PRV⁺神经元中都检测到了Avp，但仅在一个脑区域 PRV⁺神经元中同时检测到Tac1和Npy，而这就是神经调节剂在上游神经元中的特定表达。这说明，Connect-seq获得的数据可将分子图叠加在CRHNs上游神经回路的解剖图上。因此，特定应激源的功能反应可以映射到特定区域中的上游神经元子集里，由此提供对解剖与分子图的功能的数据支持。

图6 ：单个信号分子的上游神经元表达映射至大脑特定区域 （A）图显示在PRHB177感染CRHN后，在不同脑区中为不同神经调节剂（Avp，Tac1，Npy或Hdc）标记的PRV⁺神经元的百分比。误差线为SEM。相同的数字表示每种条件下的动物数量（″n″）。（B）CRHNs被PRVB177感染，并在d3pi上用神经肽核糖核蛋白（绿色）和抗HA抗体（红色；PRV⁺细胞）共染色了脑切片。箭头指示共标记的神经元。

讨论

大脑包含着许多不同功能的神经回路，但这些回路的神经元组成及其各自的功能在很大程度上还不太确定。尽管尽年来通过运用单细胞RNA-seq技术，大家已经定义了多种小鼠脑神经元的转录组图谱。但关于这些神经元如何控制其功能以及神经回路之间的相互作用知之甚少。最近的技术已能完成通过遗传学标记和定义神经元子集，但尚未在单个上游神经元的水平上研究单个神经元多样性。在本研究中，作者设计了一种叫Connect-seq技术,该技术利用病毒行踪结合单细胞转录组学来揭示特定神经元上游中的单个神经元的分子特性，并阐明它们与神经递质及神经调节剂的关系。虽然只覆盖了CRHNs上游少量的神经元，但研究者发现这些上游神经元仍表达了大量的神经递质，神经调节剂以及数十种不同的神经肽。总之，本研究首次揭示了两类神经元：一类神经元只可表达一种分子信号，而其他种类的上游神经元则还可以与许多下游神经元进行结合突触；而这些分子可与CRHNs之间进行信息传递。作者发现通过激发或抑制CRHNs的表达可调节大脑兴奋程度，CRHNs变得更为复杂。

评论

我们始终对对于大脑中的神经回路以及通路之间的相互作用这一方面了解甚少，但随着生命科学的发展，神经系统已经成为关注的热点，人们迫切的想了解其中的奥秘。本文运用了一种新的技术Connect-seq 结合单细胞转录组测序技术在不同的大脑区域识别出的单个神经调节剂并对于上游神经元的子集进行详细解析。Connect-seq技术可以构建分子图并叠加在神经回路的解剖图上，以此用于研究正常情况下和疾病中这两种状态下的各个神经元组件及其作用。

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