科研 | Nature子刊：肿瘤微环境在单细胞分辨率下的代谢情况
编译：小北，编辑：十九、江舜尧。
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肿瘤环境由多种类型细胞及其不同的环境构成，在本研究中研究人员开发了一种计算通道来研究单细胞的代谢程序。在两种人类代表性的肿瘤（恶性黑素瘤和头颈癌）中通过算法确定了肿瘤内的代谢图谱。研究者报道了在单细胞分析和伴有高代谢活性的恶性肿瘤细胞中存在的一个整体的不协调，且研究发现线粒体程序中的突变体是导致代谢异质性的主要诱因。在所有测试的细胞类型中糖酵解作用和线粒体程序的表达与缺氧通路密切相关。免疫细胞和基质细胞可以通过他们的代谢特征而被区分开。总而言之，该文建立了运用单细胞表达数据来描述代谢的基本框架并且定义了肿瘤微环境的基本原则。
论文ID
原名：Metabolic landscape of the tumor microenvironment at single cell resolution
译名：肿瘤微环境在单细胞分辨率下的代谢情况
期刊：Nature communications
影响因子：11.878
发表时间：2019年8月21日
通讯作者：肖正涛
通讯作者单位：美国杜克大学
DOI：10.1038/s41467-019-11738-0
研究介绍
肿瘤细胞代谢重编程以支撑细胞对能量、生物量、氧化还原维护以及细胞间交流的需求。细胞内的代谢受基因和环境因素的影响，包括肿瘤进化过程中驱动因子突变、起源组织以及局部的营养环境。然而围绕肿瘤代谢的大多数结论是从细胞培养模型和模型器官获得的，能够直接观察到的细胞代谢非常少。受环境因素的影响，在实验室培养条件下肿瘤代谢相较于体内环境表现出不同的特性，这些差异在人类模型器官的代谢中同样存在。关于肿瘤代谢的结论也是每个细胞基因和环境的改变导致反映的整体均数。
肿瘤细胞存在于不同类型的非肿瘤细胞构成的微环境中，包含肿瘤相关的成纤维细胞、免疫细胞、内皮细胞或者其他基质细胞的，这些细胞在促进肿瘤生长中发挥重要作用，例如，癌症相关的成纤维细胞释放细胞因子和趋化因子在接收信号中发挥重要作用，肿瘤细胞中的免疫室控制免疫调节，内皮细胞为脉管系统抵御微环境提供营养。不同的细胞都有不同的代谢需求来满足特异的功能，此外每种细胞都经历不同的营养微环境、细胞外不同的信号、起源于不同的细胞从而有不同的突变图谱。因此在细胞层面每个细胞都有不同的代谢状态。在单细胞层面直接观察体内每个细胞的代谢状态更是困难的。关于肿瘤微环境的研究结论大多都是通过体外模型例如共培养系统或者免疫组化染色测量单个代谢酶的表达。对肿瘤微环境内单细胞水平的代谢状况有待进一步探讨。
代谢及其相关的表型生物学受代谢物的浓度及其流速影响。在人体内这些指标的测量是困难的，且目前为止仅在实体瘤通过全基因组代谢基因表达间接测量。随着单细胞测序技术的引入，检测整个组织或者肿瘤中的单个细胞的代谢表达图谱成为可能。基于目前基因表达提供的代谢通路活性的信息，且现有的报道基因表达能够预测代谢的流速。利用单细胞测序技术有望提供更多人类肿瘤单细胞水平的代谢信息，从而更加全面的理解肿瘤代谢的异质性。
在本文中研究者选取两个代表性的肿瘤，恶性黑色素瘤和头颈癌测量了超过9000个单细胞的代谢基因表达图谱，结果发现在癌细胞中代谢通路普遍更加活化，并且单个肿瘤细胞的代谢特征通过实体瘤中测量的方法很难测得。在癌细胞及非癌细胞中线粒体活性突变是代谢异质性的主要原因且在单细胞层面糖酵解和氧化磷酸化与缺氧通路是一致的。研究者同时确定了不同的免疫细胞和基质细胞中的代谢特征，并且找到了与体外培养条件下不同的代谢行为。这些发现开始确立了在肿瘤微环境中恶性转化是如何影响癌细胞和非癌细胞的代谢表型。
结果
单细胞水平代谢基因表达图谱
研究者开发了一种在单细胞水平分析代谢基因表达图谱的计算机方法（图1）。简而言之是将缺失值填充和数据标准化方法运用到基因表达图谱来解释技术噪音的影响。然后利用聚类分析定义单细胞水平代谢程序的整体结构特征。利用开发的定量度量来确定细胞类型特异性的代谢程序，同时为定量肿瘤细胞或者非癌细胞的代谢异质性设计算法。研究者利用人类黑色素瘤（包含4054个细胞）和头颈癌（包含5502个细胞）单细胞RNA-seq的数据验证了算法的可靠性。这一数据库筛选是根据其含有最多的细胞数量和最详细的细胞类型注释，且包含不同基因型和表型的肿瘤细胞和非癌细胞，因此在每种类型细胞中能够深入分析代谢基因的表达及其信号通路。
研究者首先利用t-SNE的方法对数据库中包含的1566个代谢基因进行了整体结构的分析结果发现肿瘤细胞中代谢基因的表达大多受病人特异的因素调控，这一现象同样在肿瘤细胞代谢基因表达图谱的高度相关性得到进一步的验证。在肿瘤细胞中发现了高度的相似性，然而在非癌细胞中没有明显的差异，这提示在肿瘤微环境中非癌细胞的代谢没有表现出明显的异质性。t-SNE随机试验检测基因表达的聚类分析提示，肿瘤细胞的代谢可塑性反应了在基因表达上固有的灵活性影响了代谢的和非代谢的基因。
以上结果均提示肿瘤细胞表现出更高的代谢可塑性，且导致了相较于非癌细胞更易导致肿瘤微环境中细胞的特异性代谢重编程。
细胞特异性的代谢重编程
研究者进一步探究了不同细胞中代谢通路突变体的整体特征。为了对代谢通路的活性进行定量，研究者开发了代谢通路活性值（PAS）来定义这条通路在所有细胞中基因的相对表达水平（图2）。同时为了进一步比较不同细胞种属之间的差异，研究者利用反卷积法对基因表达的值进行调整结果发现四个常用数据库中的表达值分布高度相似。在80条至少包含5个基因的信号通路中至少一种细胞类型中有超过70条的信号通路高度表达（PAS＞1，p＜0.01），这一结果提示大多数代谢通路的活性由细胞类型决定。例如不同细胞类型中氧化磷酸化和糖酵解的差异表达进一步由不同类型细胞中这些通路基因的平均表达分布值验证（p＜0.01）。KEGG信号通路分析将代谢通路划分为11个类别，并且利用费希尔精确检验评估了每个类别中上调信号通路的富集情况。这些类别反映了细胞代谢的不同情况，包括糖代谢、氨基酸代谢和核苷酸代谢。出乎意料的是，在某一特异的细胞类型中大多数类别并不在上调的信号通路中富集（黑色素瘤中11/11，头颈癌中10/11；p＞0.05），提示在所有的类别中每种细胞类型都经历代谢通路整体的上调或者下调。在黑色素瘤和头颈癌中肿瘤细胞拥有最大数量上调的代谢通路，黑色素瘤细胞有45条通路上调，癌相关成纤维细胞20条，巨噬细胞为22条，其他类型细胞都少于10条；头颈癌细胞中有56条通路上调，成纤维细胞中28条，巨噬细胞中24条，B细胞为11条，其他细胞类型都少于10条。并且上调的信号通路包括细胞代谢的多个方面，例如中心碳代谢、一碳代谢、蛋氨酸代谢、类固醇生物合成、β-丙氨酸代谢。因此与非癌细胞相比，肿瘤细胞经历一个整体上调的代谢活性，且重要的是，仅在代谢相关的信号通路中的活性是上调的。有意思的是比较数据库中黑色素瘤和头颈癌代谢信号通路，结果发现两种癌症中T细胞（Spearman’s correlation = 0.58, p-value = 3.6e-8）、肿瘤细胞（Spearman’s correlation = 0.45, p-value = 4.9e-5）、内皮细胞（Spearman’s correlation = 0.43, p-value = 1.2e-4）和巨噬细胞（Spearman’s correlation = 0.44, p-value = 6.9e-5）高度一致，而在B细胞和成纤维细胞的代谢通路（Spearman’s correlation < 0.1, p-value > 0.01 for both cell types）中几乎不相关，这也提示这些细胞的代谢对环境的因素和免疫细胞的效应状态极为敏感。
研究者为了进一步评估在单个肿瘤细胞中的信号通路活性是否与实体瘤组织样本中的转录图谱一致，利用实体瘤中的RNA-seq数据计算了代谢活性值并且与TCGA数据库中的组织样本比对，由于TCGA数据库中不含黑色素瘤的正常组织，研究者比较了含43对正常的和肿瘤样本的头颈癌数据库。为了比较TCGA中实体瘤基因表达值与单细胞RNA-seq数据，研究者重新构建了肿瘤细胞中所有单细胞的基因表达图谱，通过与实体瘤中的TCGA数据比较发现基因的表达水平与TCGA数据库中的肿瘤样本高度相关（average Pearson’s R = 0.77）。与非癌组织相比，肿瘤样本中有6条信号通路上调34条信号通路下调（p-value < 0.01），且有24条信号通路的活性图谱在实体瘤和单细胞中是一致的。显著的是，25/56信号通路在单个肿瘤细胞中是上调的在非瘤细胞中是下调的。单细胞和RNA-seq的差异是细胞异质性导致的。
以上结果均证实单细胞水平基因表达图谱中代谢活性显著富集。
肿瘤细胞代谢的异质性
肿瘤细胞内的代谢重编程受营养供应、细胞间交流影响，探究肿瘤微环境的影响因素也非常有意义。研究者为了确定细胞内代谢异质性的主要原因，通过PCA和GSEA确定了代谢通路中富集的突变基因（图3）。在选用的两种肿瘤中，氧化磷酸化和三羧酸循环对代谢的异质性发挥重要作用，这一结果提示线粒体活性的突变是肿瘤细胞代谢异质性的主要原因。研究者进一步探究了线粒体活性和氧气、氧气等环境因素之间的联系。由于细胞内营养物质的状态无法直接测量，研究者利用已知与缺氧通路相关基因的平均表达水平来衡量。利用氧化磷酸化相关基因的表达水平来替代线粒体的活性。同时糖代谢通路作为细胞生存和增殖能量和原材料的供应通路同样受到了研究者的关注，同时在癌症代谢过程中糖代谢与氧化磷酸化的关系仍然是一个热点。研究者发现在两种肿瘤细胞中糖代谢和缺氧通路的特征高度相关（黑色素瘤中Pearson’s R = 0.72，头颈癌中Pearson’s R = 0.52），这一结论与之前的报道缺氧能够提高糖代谢的活性一致。重要的是研究者发现氧化磷酸化和糖代谢之间正先关，两者在CCLE取的肿瘤细胞培养中是缺少的。进一步揭示有氧呼吸和缺氧信号通路这种出乎意料的联系是肿瘤微环境中单个肿瘤细胞的独特特征。此外两种肿瘤细胞中氧化磷酸化、糖代谢以及缺氧的低表达水平与执行期负调控的基因上调密切相关，这一亚群的细胞凋亡减少，有效促进肿瘤的发展。
以上结果均证实线粒体的氧化磷酸化是肿瘤代谢异质性的主要原因，氧化磷酸化为了适应肿瘤微环境中氧供应的变化不与提供能量的糖代谢相互排斥。
非癌细胞的代谢异质性
在非癌细胞中代谢基因的表达图谱依据细胞类型聚类，同时在不同肿瘤中的细胞没有明显的差异，研究者进一步分析了非癌细胞中的代谢异质性。通过PCA和GSEA以及氧化磷酸化突变体三羧酸循环发现，在非癌细胞中氧化磷酸化和三羧酸循环同样是代谢异质性的主要原因。这一结果提示在非癌细胞中线粒体的活性同样是代谢异质性的主要原因。
为了进一步评估非癌细胞中线粒体的活性如何与氧气供应联系，研究者在每种细胞类型中检测了氧化磷酸化、糖代谢活性与缺氧相关的特征。在头颈癌的数据库中，除了巨噬细胞其他细胞均表现出糖代谢、氧化磷酸化、缺氧显著相关。联系癌细胞中的结论，研究者的发现挑战了长久以来公认的概念：中心碳代谢的代谢重编程在糖代谢和线粒体呼吸中扮演开关的角色。在单细胞水平，细胞面临着更严重的氧气消耗来上调糖代谢和线粒体的氧化磷酸化，帮助肿瘤细胞与其他细胞竞争有限的资源。在单细胞RNA-seq数据库中的所有细胞中缺氧特征与能量生产的正相关高度保守（图4）。
非癌细胞亚型的代谢特征
免疫细胞和基质细胞等非癌细胞是肿瘤微环境的重要组成部分，这些细胞分化成不同的亚型扮演不同的角色，而这一过程需要代谢重编程来满足细胞对自主代谢的需求同时与其他细胞能够相互作用。研究者利用scRNA-seq对T细胞和成纤维细胞亚型进行代谢特征的分析，T细胞和成纤维细胞是黑色素瘤和头颈癌数据库中最大的非癌细胞群体。T细胞首先依据CD4和CD8A的表达分化成CD8+和CD4+，CD4+T细胞进一步依据FOXP3和CD25的表达分化成调节型T细胞和辅助型T细胞。研究者通过GSEA分析确定每个亚型中代谢通路的富集，且发现氧化磷酸化是区分T细胞亚型最重要的信号通路：CD4+T细胞相较于CD8+T细胞氧化磷酸化的水平显著更高。有趣的是，相较于辅助型T细胞，调节型T细胞有更高的糖代谢水平（图5）。而这一结论与之前的报道辅助型T细胞的糖代谢水平更高相矛盾。另一方面氧化磷酸化倾向于CD4+T细胞和调节型T细胞与之前的报道是一致的。以上证据再次说明线粒体氧化代谢是T细胞亚型的普遍代谢特征，这些结果也提示肿瘤微环境中免疫细胞亚群的代谢特征有别于正常组织中的生物学行为。
研究者进一步探究了成纤维细胞亚群中的代谢特征，成纤维细胞在正常组织中对伤口愈合等过程发挥重要作用，在癌组织中能够通过细胞间交流促进肿瘤细胞生长。依据之前的报道，在头颈癌中1422个成纤维细胞被分成两个亚群CAFs和肌纤维细胞。研究者通过GSEA分析比较了两个成纤维细胞亚群的代谢基因表达。结果发现15条代谢信号通路上调从而区分开两个细胞亚群。另一方面，肌醇磷脂代谢是肌纤维细胞中唯一上调的代谢通路，这也暗示CAFs的代谢活性更高。同时在CAFs中糖酵解显著上调，糖酵解产生过量的乳酸被邻近的肿瘤细胞利用来支撑生长。同时研究者发现了一些其他的代谢通路，包括花生四烯酸代谢、亚油酸代谢以及聚糖生物合成和降解。以上证据均证实CAFs的代谢表型能够帮助他们与其他细胞相互作用并且调节肿瘤内的微环境。
结论
研究者通过利用肿瘤中单个细胞的基因表达谱，用以区分免疫细胞和间质细胞亚群的代谢特征，直接反映肿瘤及其微环境的代谢情况，包括许多已知和未知的细胞类型。对肿瘤微环境与单细胞测序技术联合应用开辟了新的前景。
拓展
随着单细胞技术的应用，结合肿瘤微环境的变化，目前相分离备受研究的瞩目。在肿瘤微环境中小分子信号传递、细胞能量与物质代谢、细胞的趋向性，任何一个过程的改变都会影响机体的正常活动。
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