编译：罗睺，编辑：十九、江舜尧。
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导读
单细胞RNA测序（scRNA-seq）可以量化单个细胞中的基因表达。单核RNA测序（snRNA-seq），已使从冷冻保存的样品中检测稀有细胞类型成为可能。糖尿病肾病的组织学表征包括肾小球基底膜增厚，肾小球系膜扩张和足细胞缺失。然而，人们对导致疾病进展的细胞类型和信号通路知之甚少。研究者假设在早期糖尿病肾病中肾皮质的snRNA-seq将揭示信号通路和基因表达模式的变化，这将反映出对高血糖症的最早适应性变化。研究者对冷冻保存的人糖尿病肾样品进行了无偏性单核RNA测序（snRNA-seq），以从3个对照和3个早期糖尿病性肾病样品中产生23980个单核转录组。最终数据集中显示了肾脏的所有主要细胞类型。并行比较显示了基因表达中特定于细胞类型的变化，这对于离子转运，血管生成和免疫细胞活化很重要。结果表明糖尿病性上肢粗大，远端曲小管和主细胞均采用与钾分泌增加相一致的基因表达特征（包括Na+/K+-泵，WNK1，盐皮质激素受体和NEDD4L表达，以及细胞旁路钙和镁的重吸收降低）。研究者还在肾小球细胞类型，近曲小管，远曲小管和主细胞中发现明显的血管生成特征。这些结果表明增加的钾分泌和血管生成信号可代表人类糖尿病肾病中早期肾脏反应。
原名：The single-cell transcriptomic landscape of early human diabetic nephropathy通讯作者：本杰明·汉弗莱斯（Benjamin D. Humphreys）作者单位：华盛顿大学圣路易斯发育生物学学院、医学系肾脏病科
组织样本：肾脏组织取自在布莱根妇女医院(波士顿，MA)接受部分或根治性肾脏切除治疗肾肿块的患者，未发生肿瘤的皮层组织在10月被冷冻保存。
单核分离和文库制备：用裂解缓冲液、蛋白酶和RNase抑制剂分离细胞核。样品均质，过滤，离心，再悬浮计数。制备10× Chromium文库。
生物信息学和数据分析：单核测序数据用zUMI（v2.0）处理。质量过滤后使用STAR（2.6.0）将其对比到人类基因组（hg38）。研究者对独特的内含子和外显子读数进行了量化，以生成原始计数矩阵，并将其导入到Seurat。随后对Seurat对象进行归一化和缩放。使用PCElbowPlot函数估计主成分的数量。使用典型相关分析和RunMultiCCA函数创建了一个完整的数据集。研究者通过对齐CCA子空间得到一个新的降维矩阵并进行聚类。对单个聚类进行差异基因分析，并使用Seurat进行可视化。下载了公开可用的外周血单核细胞数据集，结合白细胞亚群分析KRIS标记。
配体-受体相互作用分析：为了研究配体-受体的相互作用，检查了肾小球或肾小管间质细胞类型，要求：1）配体、受体或两者均差异表达；2）其同源对在伴侣细胞类型中表达。
功能基因集富集分析和基因重叠：使用默认参数的R包fgsea进行基因富集分析。使用R包GeneOverlap和默认参数，对醛固酮敏感基因与细胞型特异性差异表达基因进行了比较。
免疫荧光研究：通过共聚焦显微镜获得图像。通过从综合荧光密度中减去总主细胞面积乘以背景荧光，计算出总校正的靶标免疫荧光。
从3个非糖尿病对照和3个糖尿病患者的肾切除术后的肾肿块中取样（肾皮质）。糖尿病患者的A1c升高，肾小球膜硬化和肾小球基底膜增厚。患者年龄为52至74岁。估计的肾小球滤过率范围为56至85 mL/min/1.73m2，两组之间无差异。与对照组相比，三分之二的糖尿病患者中有两名患有蛋白尿，其总体肾小球硬化，间质纤维化和肾小管萎缩（IFTA）比例增加。在2名患有蛋白尿的糖尿病患者和没有蛋白尿的糖尿病患者之间进行了差异基因表达和基因集富集分析（GSEA）。与对照组（3.6±0.32 mEq/L）相比，糖尿病组（4.2±0.05 mEq/L）有升高的血清钾水平的趋势，但无统计学意义。
snRNA-Seq识别肾皮质中的所有主要细胞类型
共有23980个细胞核通过过滤器，平均每个核有2541个基因和6894个独特的分子标识符。11种肾细胞类型(图1， A和B)和4种免疫细胞类型(图1，C和D)通过非监督聚类和在批校正后的谱系特异性标记的表达来鉴定。糖尿病患者的白细胞数量增加，包括T细胞、B细胞、单核细胞和浆细胞。图1：糖尿病和对照样品的整合snRNA-seq数据集。A. 将糖尿病和对照样品整合到单个数据集中，并使用Seurat进行聚类。C. 从综合数据集中提取白细胞簇（LEUK），并将其亚簇化为白细胞子集。
糖尿病肾小球中的基因表达变化
研究者在足细胞，肾小球系膜和内皮细胞中鉴定了差异表达的基因。这些转录本中约有10%以前曾被报道过来自晚期疾病患者的糖尿病肾小球的微阵列研究。尽管足细胞丢失是糖尿病肾病的早期表现，但糖尿病患者足细胞数(平均98±15)与对照组相比(122±88，P=0.66)差异不显著(P=0.66)，这可能是因为样本量较低。
差异基因表达（图2A）和GSEA显示了对调节内皮细胞增殖和离子稳态的重要途径。与原发性膜性肾病中自身抗体的靶标PLA2R1和THSD7A在糖尿病足细胞中的表达有所增加相比，PLA2R1被下调了6倍。2例患有蛋白尿的糖尿病患者的GSEA与无蛋白尿糖尿病患者的GSEA比较，生长因子反应富集，包括CTGF的上调，而CTGF以前与糖尿病肾病的发病机制有关。图2：糖尿病肾小球中的差异基因表达和细胞间信号传导。将糖尿病和对照样品整合到单个数据集中，并使用Seurat在细胞类型内比较基因表达。显示了针对（A）足细胞，（B）肾小球系膜细胞和（C）内皮细胞的差异表达基因。配体-受体相互作用是通过一个公开的数据库推断出来的，包括（D）差异表达的配体-受体细胞间信号通路和（E和F）足细胞和系膜中所有可能的配体-受体信号通路。共鉴定出512个肾小球系膜细胞，可能代表了肾小球系膜细胞和血管平滑肌细胞的混合物。两者均表达ITGA8和PDGFRB（人类蛋白质图谱）。GSEA显示出GO生物学过程的富集包括血管生成，这是由细胞外基质成分（COL4A1，COL4A2）和调节基因（MYH9，NR4A1，SLIT3，ADAMTS12）表达增加驱动的。在CFH，CLDN1，VCAM1定义的细胞簇中观察到CFH表达降低和AKAP12，它们可能代表壁上皮细胞。总共存在1179个内皮细胞，GSEA确定了碳水化合物转运，白细胞迁移和血管内皮细胞迁移的富集。差异表达的基因（图2）包括细胞外基质成分（COL4A1），葡萄糖转运蛋白（SLC2A3，SLC2A14），和血管生成的调节剂（VEGFC，VCAM，NR4A1，MYH9，ITGB1，PRCP，TMEM204，HDAC9，MEF2C）。血管内皮细胞中存在血管生成的信号，这与以前关于实验性糖尿病的报道是一致的，并且异常的肾小球血管生成是与肾小球肥大相关的糖尿病肾病的特征，并增加了内皮生长因子的表达，VEGFC和SEMA3D都属于一类称为信号素的基因，它可以指导内皮细胞的运动和血管形成。
糖尿病肾小球信号网络改变
为了探讨细胞间信号的改变，研究者在肾小球细胞类型中检测了差异表达的配体-受体对(图2D)，它代表了所有相互作用的一个子集(图2，E和F)。糖尿病系膜细胞CCN1和SLIT3表达增加。CCN1是一种生长因子诱导基因，其通过与足细胞(ITGAV、ITGB3、ITGB5)和内皮细胞(ITGB3)表达的细胞外蛋白相互作用调节组织修复。SIT3通过与ROBO2相互作用来调节细胞迁移，ROBO2也由足细胞和内皮细胞表达。肾小球系膜细胞表达NAMPT，调节胰腺β细胞的胰岛素分泌，而糖尿病足细胞则显示INSR的表达降低。糖尿病内皮细胞表达增加LTBP1，其调节潜在的TGF-beta复合物的靶向性。
糖尿病性肾病中的免疫细胞浸润
总共鉴定出347个白细胞，由49％的T细胞，21％的B细胞，23％的单核细胞和7％的浆细胞组成（图1C）。与对照组相比，糖尿病患者的白细胞增加了约7至8倍，这与以前的报道是一致的。但没有在糖尿病样本中检测到大量的巨噬细胞。样本与2个公开的外周血单个核细胞(PBMC)数据集进行比较。数据集集成识别NK细胞、T细胞和单核细胞亚群，这使得研究人员可以测量炎症标志物的变化。肾脏风险炎性特征(Kris)是可预测糖尿病肾病的进展。研究者观察到TNFRSF21(LFC = 1.12，P=7.6e-58)在浸润性糖尿病CD14单核细胞亚群(图3A)中的表达增加，这是为数不多的Kris标记物之一，显示了尿排泄增强与终末期肾病之间的相关性。ILR1CD16+单核细胞和抗原呈递细胞中IL18R1增加，而CD4+和CD8+ T细胞中IL18R1增加。这些数据表明，浸润的免疫细胞有助于产生KRIS标记。A. 从整合数据集中提取的白细胞亚群被询问以获得炎症标记(KRIS)的差异表达。B. 使用R包fgsea对从Henle环（LOH）到收集管的细胞进行基因集富集分析，并将其对比到基因GO项。C. 利用Seurat技术鉴定了与远端肾单位离子转运有关的差异表达基因。
糖尿病性近曲小管和上肢增粗的基因表达变化
近曲小管（PCT）有6518个细胞，并富集用于调节IL-8产生和血管生成。糖尿病PCT的白蛋白转运蛋白，LRP2和血管生成调节剂：NRP1，VCAM1和HIF1A的表达增加。新陈代谢发生了变化：PCK1的上调和INSR的下调。磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（PCK1）是调节糖异生和氨生成的控制点。上肢增粗（TAL）具有3788个细胞，主要富集于调节钠离子转运蛋白活性、调节钾离子和细胞连接组装。由ATP1A1，ATP1B1和FXYD2编码的钠钾泵（NKA）亚基减少，WNK1及其下游效应器STK39也减小，从而适度调节钠钾离子共转运体（NKCC2）。但是，由于TALCC中的钠和钾转运是由NKCC2和NKA的串联操作驱动的，因此这些变化有望减少Na+和K+的重吸收。TAL中转运的抑制作用可能与基底外侧钾通道KCNJ16的减少以及钙敏感受体CASR的增加有关，后者会抑钠钾离子重吸收并通过降低NKCC2来驱动钙排泄。CLDN16下降，这导致集合管钠输入增加、钾排出增加和钙和镁的重吸收。
糖尿病诱导基因表达的改变，促进远曲小管和主要细胞中钾的分泌
远曲小管管有1652个细胞，富集了离子转运、钙介导的信号传导和对类固醇激素的反应。TAL中钙转运减少的结果可能是钙选择性通道TRPV5和基底外侧质膜钙ATPase（PMCA）ATP2B4表达增加（图3C），NDD4L和SGK1升高，促进ENAC的表面表达。总共富集了2909个主细胞，富集于调节远端肾小管发育，钾离子转运，钠离子转运以及对激素的反应。糖尿病原代细胞的ATP1A1，ATP1B1，ATP1B3和调节剂FXYD4的表达增加，从而增加了NKA对Na+和K+的亲和力（图3C）。免疫荧光研究也显示NKA表达增加。糖尿病主细胞WNK1减少。对ENAC(28)负调控的NEDD4L的降低将进一步增加钾分泌。水通道蛋白-3的表达也增加，这对于浓缩尿液是重要的，并且在链脲佐菌素诱导的糖尿病中增加。有趣的是，研究发现908个醛固酮和盐敏感转录本在统计学上有显著的重叠。在上肢增粗、远曲小管和主要细胞中检测到的差异表达基因提示对醛固酮信号的保守反应。在这项研究中，研究者报告了人类糖尿病性肾病的单核RNA测序数据集。糖尿病患者有轻度至中度的肾小球硬化和间质纤维化，但保留了早期疾病特征的eGFR。通过比较特定细胞类型的基因表达，研究者证明了促血管生成基因的上调和对细胞运动以及细胞骨架重排很重要的途径。此外，糖尿病诱发了上肢增粗，远曲小管和协调促进钾分泌的主细胞的适应性改变。上肢粗大（TAL），远曲小管（DCT2）和主要细胞中基因表达的早期变化共同促进钾的分泌（图4），同时减少细胞旁路钙和镁的重吸收（图5）。TAL中NKA，KCNJ16和NKCC2活性的降低预计会损害跨细胞钠和钾的重吸收，并降低钙和镁的细胞旁路重吸收。观察到的钙敏感受体（CASR）的表达增加和CLDN16的表达下降（调节紧密的连接通透性）会加剧这种情况。这些变化伴随着收集管中SGK1表达的增加、ENaC和钾分泌的重要调节剂NEDD4L的表达减少。有趣的是，患有1型或2型糖尿病和微量白蛋白尿的患者显示红细胞中NKA的活性明显降低。NKA活性降低可能是由于早期代偿机制的丧失所致，并解释了糖尿病肾病患者发生高钾血症和4型肾小管性酸中毒的倾向。实际上，糖尿病患者的血清钾水平有增加的趋势，这可以解释促进钾分泌的转录变化。或者，这种钾处理反应反映出肾单位的损失，因此需要每个剩余的肾单位增加钾的分泌。相比之下，晚期的远曲小管和原代细胞显示NKA表达增加，这可通过ROMK促进钾的分泌，并有望响应WNK1信号的降低而上调。预期在上肢粗大，远曲小管和主细胞中的净作用会促进钾的分泌，并可能代表对早期糖尿病肾损伤的适应性反应。或者，这些变化是对升高的血清钾和醛固酮信号传导的全身反应。图4：协调远端肾单位以促进钾的分泌。相对于对照，基因被描述为上调（绿色填充），下调（红色填充）或无显著变化（白色填充）。图5：减少钙和镁的细胞旁路重吸收。相对于对照，基因被描述为上调（绿色填充），下调（红色填充）或无显著变化（白色填充）。免疫细胞浸润是糖尿病肾病的另一个特征。研究者观察到3个糖尿病样本中有2个的T细胞，B细胞，浆细胞和单核细胞数量增加。然而，该研究确定了相对较少的白细胞。浸润的单核细胞在IFNγ信号下游（IFNGR1和IFNGR2），HLA II类组织相容性抗原（HLA-DRB1，HLA-DRB5，HLA-DQA1）和TNFRSF1B下游表达标记物，这些标记物被认为是糖尿病性肾病的生物标记物。研究者的数据集与公开可用的外周血单核细胞数据集的比较表明，浸润的CD14 +单核细胞具有增加的TNFRSF21，这是糖尿病性肾病进展的尿液标志物。本研究报道了早期人类糖尿病性肾病的snRNA-seq分析。研究者确定了糖尿病患者肾皮质中所有主要细胞类型和浸润的免疫细胞。内皮，系膜，近端小管和晚期远端小管均具有血管生成表达特征。研究者还观察到了钠钾泵和其他与运输相关的基因在上肢增粗，远曲小管和主细胞中的表达变化，表明尿钾分泌增加。这些变化伴随着钾分泌，负调控的表达减少WNK1和NEDD4L，并增加钙敏感受体CASR及其下游效应物CLDN16的表达，提示减少的细胞旁路钙和镁重吸收。糖尿病样本中浸润的免疫细胞明显增加，并表达了最近鉴定出的可预测糖尿病肾病进展的标志物。这些改变可能有助于确定疾病进展的生物标志物或适合早期干预的信号通路。该研究的局限性在于患者数量相对较少，需要更多的数据支持。
