大鼠骨髓间充质干细胞分离操作方法
(1)取SD大鼠(2周龄),颈椎脱臼法处死后立即用75%乙醇浸泡,移入超净工作台内,用大头针固定大鼠四肢于工作台面的泡沫板上。
(2)碘酒擦拭四肢,再用酒精棉球擦拭,无菌条件下用灭菌消毒后的镊子和剪刀分离出大鼠股骨和胫骨,剔除骨头表面肌肉,PBS溶液冲洗两遍。
(3)从中间剪断股骨和胫骨,用2ml无菌注射器吸取DMEM/F12溶液冲出骨髓细胞多次,再用针头吹打,吸管吸入离心管内,1000r/min离心5min,弃上清,用PBS重悬细胞。
(4)缓慢将细胞悬液加入预先装有5mL淋巴细胞分离液的15mL离心管内,保持细胞悬液在淋巴细胞分离液上层,注意不要搅动液面,保持二者分层界面。
(5)2000rpm离心15-25min,离心后溶液分4层,吸取中间骨髓基质细胞层(白色浑浊状),PBS洗三次。
(6)用含15%胎牛血清及青链霉素的DMEM/F12以106/mL的细胞浓度接种于25cm2培养瓶中,置37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。
(7)24小时后弃去培养液(看细胞贴壁情况),PBS冲洗 2-3次去除未贴壁细胞,加入培养液继续培养。以后每3d半量换液1次,一般10d细胞生长融合。
(8)经0.25%胰酶消化,1:2传代,其后一般3-5d传代1次,选取生长良好的第三代细胞进行后续实验。
细胞形态
骨髓间充质细胞原代培养过程中,约24小时即可出现贴壁生长,细胞呈圆形、梭形、三角形生长缓慢。换液后细胞增殖明显,出现以梭形为主的多种形态,10-14天70%-80%可融合达到传代标准。传代细胞形态单一,呈梭形或扁平型,增殖至细胞融合时呈漩涡状和放射状排列。
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