牙源间充质干细胞分离操作方法

（1）取SD乳大鼠，颈椎脱臼法处死后立即用75%乙醇浸泡，移入超净工作台内，用大头针固定大鼠四肢于工作台面的泡沫板上。

（2）碘酒擦拭四肢，再用酒精棉球擦拭，无菌条件下用灭菌消毒后的镊子和剪刀解剖出大鼠已萌的牙根发育中的第一磨牙，沿Hertwig上皮起始处横切分离出包括根尖乳头、Hertwig上皮、牙囊的根端复合体，PBS溶液冲洗两遍。

（3）组织块剪碎，然后采用酶消化法消化培养，单细胞悬液以1X105细胞/ml在加了15%胎牛血清及青链霉素的a-MEM培养基中，置37℃、5%CO2恒温培养箱进行培养。

（4）24小时后弃去培养液（看细胞贴壁情况），PBS冲洗 2-3次去除未贴壁细胞，加入培养液继续培养。以后每3d半量换液1次，一般10d细胞生长融合。

（5）经0.25%胰酶消化，1：2传代，其后一般3-5d传代1次，选取生长良好的第三代细胞进行后续实验。

细胞形态

牙源间充质细胞原代培养过程中，约24小时即可出现贴壁生长，细胞呈圆形、梭形、三角形生长缓慢。换液后细胞增殖明显，出现以梭形为主的多种形态，10-14天70%-80%可融合达到传代标准。传代细胞形态单一，呈梭形或扁平型，增殖至细胞融合时呈漩涡状和放射状排列。