IF 14 非肿瘤的顶刊单细胞套路，亮点在这里！
探索生信之美，解构每一篇文章的故事
解读高分文章，揭示生信之美~小伙伴们大家好啊，我是风间琉璃。经历了短暂快乐的春节，大家是不是已经回到实验室或者医院继续开始工作了呢？（反正琉璃已经回到临床默默打工了，默默哭泣中……）。不过学习总是要学的。最近我们风哥开始更新单细胞专题啦~本期琉璃就给大家带来一篇单细胞文章解读，深入浅出，让读完的小伙伴明白，单细胞分析我们也自己可以做~
一、文章标题和背景
动脉粥样硬化作为心血管领域的主要疾病，具有明确的细胞异质性。但是板块内复杂的分子表达模式并未被完全探索。因此作者通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞ATAC测序（scATAC-seq）方法对人类的斑块组织的转录层次和表观组学层次进行探索。本文《Microanatomy of the Human Atherosclerotic Plaque by Single-Cell Transcriptomics》发表于2020年11月发表在《Circulation Research》杂志上，2020年影响因子14.47。我将从细胞鉴定、细胞通讯、scATAC-seq、GWAS分析这五个方面解读这一篇文章。并在最后谈谈通过挑圈联靠解读单细胞文章的思路。
二、细胞类型鉴定
首先根据题目，我们知道，作者其实就是对粥样斑块的细胞类型进行深入解剖，明确组织中各大类细胞的细胞亚型。Figure1作者将18例病人的斑块组织总共3282个细胞进行分析（Figure1A）。作者一共分出14个大群，并根据每个群高表达的基因（也就是marker）将每一个cluster划分成特定的细胞类型（Figure1B-D）。并且作者进一步于常规转录组进行相关性分析，从而验证分群的可靠性。
接下来大类分群之后作者对每一类细胞进行亚群分析，进一步揭示不同细胞亚型基因表达模式的差异。
Figure 2分析了血管内皮细胞，发现内皮细胞展现出活化和转分化的潜质，在亚群分析，作者发现内皮细胞一共有四个群（E0/1/2/3）,并进一步根据其表达的特异性基因（Figure2A/B/C）。其中E0表达血管新生的marker，E1表达细胞外基质的marker，E2表达细胞活性的marker。因此E0/E1/E2提示与内皮细胞的活化以及加速炎症反应相关。而E3表达典型的平滑肌细胞marker，功能富集分析提示内皮细胞间充质转化（EndoMT）的过程或者反之亦然（Figure2D）。并通过免疫组化的方式展示平滑肌marker和内皮细胞marker在斑块内确实具有重叠区域。
Figure3中作者将T细胞群中CD4表达值大于CD8表达值得细胞定义为CD4 T细胞。并进一步对CD4 T细胞进行分析出五个亚群（CD4.0-CD4.4）（Figure3A）。并根据其特异性marker对其功能进行鉴定（Figure3B-C）。其中CD4.0、CD4.1细胞群主要表达细胞毒性的基因。作者进一步分析了CD4.0细胞群的功能（将其差异基因进行功能富集分析，Figure3D）。并通过流式分析发现CD4 T细胞中，CD28表达低的细胞GZMB也表达低（Figure3E）。
Figure4中，作者对髓系细胞群进行亚群分析，共分为5个亚群（My.0-My.4，Figure4A）。其中作者鉴定出My.0、My.1、My.2展现出不同的巨噬细胞激活状态。根据他们表达的特异性marker以及通路分析，My.0和My.1表达出炎症状态，而My.2更表现出泡沫细胞的marker（巨噬细胞吞噬脂质后）的marker（Figure 4B/C/D/E）。而My.3更多表达树突状细胞的marker，My.4可能是错分的regulatory T细胞。并且作者根据最近的鉴定小鼠的单细胞文献和本文进行对比，通过circos图和柱形图佐证本文细胞鉴定和其他文章的相似性（Figure4F-G）。
三、细胞通讯
接下来作者通过cellphoneDB分析不同类型细胞之间的相互作用。Figure5A展示内皮细胞、髓系细胞以及平滑肌细胞具有比较活跃的相互作用。作者进一步分析了髓系细胞配体和受体活性分别与其他细胞类型的相互作用（Figure5B-C）。
四、scATAC-seq
首先简单介绍一下scATAC-seq（single-cell Assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing），首先由于DNA是层层折叠压缩在染色体中，如果细胞需要完成某生物学进程，那么对应的基因需要“解开”进行转录调控，ATAC-seq就是通过高通量检测开放的DNA区域（染色质可及性，chromatin accessibility）的方式。所以scATAC-seq即从表观遗传的角度为我们分析细胞异质性提供了新视角。
接下来Figure6，作者通过scATAC-seq发现在转录层面分为髓系细胞和CD4 T细胞同样具有对应基因的区域活性增高（Figure A-D）。而对motif的聚类同样展示相同的细胞分群（My.0-My.3）。Figure6F展示的不同motif在不同细胞群的活性。接下来作者通过IRF9、RARA、RXRG、LXR、RXR等基因的位置权重矩阵(Figure6G-I)，并展示细胞毒性转录因子IRF9和My.2特异性转录因子LXR（NR1H3）区域在不同细胞亚群中检测到的reads（代表转录活性,Figure6H-J）。最后在scRNA-seq层面展示NR1H3的转录水平（Figure6K）。
五、GWAS相关分析
最后作者根据及网文先发现的163个冠心病基因易感位点，提取出对应的317个基因，根据其在斑块内所有细胞的表达水平，一共聚类出15个基因表达模式（Figure7A）。并且作者发现GWAS相关的基因主要集中在模式3、8、14中（Figure7B）。并且作者进一步分析了基因模式3、8、14主要在哪种细胞类型中高表达，最后得出结论提示主要在内皮细胞、平滑肌细胞以及髓系细胞中高表达。
六、写在最后
细胞通讯就是联字诀，根据既往的配受体数据库以及我们单细胞数据构建出不同细胞类型的交互网络。
圈字诀不用多说，即使是单细胞分析，同样也会用到GO/KEGG/GSEA等分析，协助圈定细胞类型的功能，比如文章的Figure2D。
靠字诀在单细胞层面很难进行分析，核心原因是单细胞的样本量太少（每个样本太贵啦！！）。
好啦~解读文章结束啦，小伙伴们觉得这篇文章简单嘛？如果想看更多类型的文章解读，那就多点一下赞喔~我是风间琉璃，咱们下期见~