易学的4+单细胞下游分析
前言
今天和大家分享的是2020年12月份发表在Molecular Therapy-Oncolytics杂志上的一篇文章（IF=4.115)“Clinical significance and immunogenomic landscape analyses of the immune cell signature based prognostic model for patients with breast cancer”。文章中作者通过梳理分析之前发表的单细胞RNA-Seq黑色素瘤数据，探索CD8+T细胞的异质性，挑出7个主要亚群并进行解读，最后识别出PMEL, TYRP1, EDNRB可能作为潜在的黑色素瘤治疗靶点。
Single-cell RNA-sequencing analyses identify heterogeneity of CD8+ T cell subpopulations and novel therapy targets in melanoma
单细胞RNA-seq分析鉴定CD8+T细胞异质性黑色素瘤的亚群和新的治疗靶点
一、研究背景
在复杂的肿瘤微环境(TME)中，CD8 + T 细胞在清除肿瘤中发挥重要作用。CD8 + T细胞的杀伤肿瘤功能是基于细胞分化和浸润。在浸润后，初始CD8 + T细胞将启动分化程序进入效应细胞、细胞毒性细胞和记忆性CD8 + T细胞，以实现抗肿瘤功能。多项研究揭示TME中的细胞毒性CD8 + T细胞可增强宫颈癌、乳腺癌和胶质母细胞瘤的抗肿瘤效果。然而，CD8 + T细胞功能障碍或衰竭的状态在肿瘤中经常观察到慢性抗原将触发衰竭程序，CD8 + T细胞将降低程序期间的作用，这可能涉及到防止过度免疫反应。因此，阐明CD8 + T细胞在TME中的分化程序，有助于对CD8 + T细胞的动态抗肿瘤免疫应答有更好的了解。
二、结果解读
1 确定黑色素瘤中CD8 + T细胞亚群
来自smart-seq和10X Genomics平台的59个黑色素瘤样本被纳入个分离的CD8 + T细胞。首先，根据所有基因的表达水平，使用t-分布式随机相邻嵌入(t-SNE) 方法分别发现了smart-seq 和10X基因组数据聚类结果。t-SNE 的结果显示，在smart-seq数据中识别出12个亚群，而10x基因组学数据在黑色素瘤组织中包含25个亚群。然后观察CD8 + T 细胞的信号特征，识别个特异性细胞簇的不同表达程度。对于smart-seq数据，CD8A和CD8B Journal Pre-proof 7主要在亚群0中高表达。然而，10X Genomics data对几个细胞簇(亚群6、亚群8、亚群12、亚群16和亚群17)具有特异性。随后，使用Seurat的内置算法从结果中分离出CD8 + T细胞簇，并使用 Harmony算法进行整合。最后，分离10861个CD8 + T细胞进行后续的个分析步骤。作者观察到这些CD8 + T细胞高度表达CD8 + T 细胞标记物和T细胞标记物，而几乎不表达 CD4 + T细胞标记物和黑色素细胞标记物。因此作者将CD4 + T细胞和黑色素细胞后续分析中排除了。
图 1.黑色素瘤TME中的CD8 + T细胞亚群分析
这些CD8 + T细胞被聚集成7个亚群(图1E)，使用先前报道的细胞标记物来区分它们。注释这些子群体签名的表达水平如上所示。最终，四个细胞毒性亚群，两个耗竭亚群和一个初始/记忆亚群被鉴定出来。在黑色素瘤TME中，每个亚群的细胞比例显示，细胞毒性亚群4、初始/记忆亚群、耗竭亚群2、和细胞毒性亚群3是最常见的细胞亚群。初始/记忆标志物，包括CCR7、IL7R、TCF7和LEF1，仅在初始/记忆亚群中表达。
然而，细胞毒性信号，包括PRF1、GZMA、GZMK和NKG7，在所有CD8 + T细胞亚群中广泛表达。其中PRF1、GZMA、GZMK和NKG7对细胞毒性CD8 + T细胞亚群1和3的特异性最高，而PRF1、GZMA和 GZMK在耗竭亚群2中的表达最低。结果表明，CD8 + T细胞异质性细胞毒性均存在于这些亚群中。值得注意的是,作者还发现,免疫检查点或耗竭标志(CTLA4、PDCD1 LAG3, HAVCR2和TIGIT)在几乎每一个族群广泛表达，而只有初始/记忆和细胞毒性细胞中表达相对较低。趋化因子CXCL13 在耗竭亚群1和耗竭亚群2中高表达，可与受体CXCR5结合，促进癌细胞增殖、迁移和侵袭。同样，与其他CD8 + T细胞亚群相比，CTLA4在耗竭亚群1和耗竭亚群2中有较高的表达。此外，细胞毒性亚群3也表现出不同程度的高表达抑制检查点(CTLA4、PDCD1、LAG3、HAVCR2和TIGIT)。这可能反映了高细胞毒性需要通过抑制性检查点来调节，以防止过度的免疫反应。这些结果表明，CD8 + T细胞亚群中不同表达水平的细胞毒性和免疫检查点分子可能有助于在黑色素瘤TME中异构性抗肿瘤免疫。
2 CD8 + T细胞亚群与预后相关
考虑到不同细胞亚群的异质细胞毒性和检查点，作者假设这些亚群将影响临床结果。作者从scRNA-seq数据中提取标志基因，并利用表达矩阵对471个皮肤黑色素瘤(SKCM)和1809个bulk RNA-seq样本进行反卷积。总的来说，SKCM和正常样本包含初始/记忆，细胞毒性亚群2，细胞毒性亚群3，耗竭亚群1，耗竭亚群2。然而，在SKCM和正常的177例样品中，细胞毒性亚群1和4未被发现。在检测到的亚群中，耗竭亚群2中CD8 + T细胞所占比例最大(图2A)，而正常样本中细胞毒性亚群2所占比例最大，其次是耗竭亚群2。
图2.CD8 + T细胞亚群组成与预后分析
接下来，作者进行了Kaplan-Meier生存分析来描述亚群体的预后作用。如图所示，初始/记忆和细胞毒性亚群3的高比例与良好的的临床结果相关。然而，耗竭亚群2可能导致不良预后。此外，细胞毒性亚群2和耗竭亚群1对SKCM预后没有影响。重要的是，与正常样品相比，SKCM中有更多的细胞毒性亚群3。结合生存分析结果，作者可以获得1份关于细胞毒性亚群特异性抗黑素瘤功能的证明。SKCM中耗竭亚群1的比例更高，而正常样品中细胞毒性亚群2的比例更高。在SKCM和正常样本之间，初始/记忆或耗竭亚群2的比例没有差异。作者接着探索细胞毒亚群3和耗尽亚群2在不同病理阶段的动态变化。值得注意的是，研究结果显示，随着肿瘤的进展，细胞毒亚群3的比例会降低，但在III期患者中增加。相比之下，耗竭亚群2在后期会使细胞的比例高于阶段I，尤其是在阶段II，其中细胞的比例最多。这些结果强调了CD8 + T 细胞亚群与黑色素瘤预后和病理进展相关，还揭示了CD8 + T细胞亚群在黑色素瘤和正常样本中的比例差异。
3 异质途径活性的景观
为探究不同CD8 + T细胞亚群中通路是否存在异质性首先进行了GO、KEGG、GSEA和通路活性分析。GO分析表明，耗竭亚种群2具有明显的生物学过程，亚种群中富集的过程很少。Naive /memory和细胞毒性亚群3具有类似的生物学过程。KEGG 的结果发现每个CD8 + T细胞具有相当大的异质性。氧化磷酸化在耗竭亚群1和耗竭亚群2中显著富集。非酒精性脂肪肝、产热和心肌收缩仅在耗竭亚群中富集。
此外，人类免疫缺陷病毒1感染和T细胞受体信号通路仅在细胞毒性亚群3中显著富集。这些通路在不同细胞亚群中的差异可能为作者提供了异质性结果的线索。然后作者使用代谢基因组来评分所有的细胞亚群，并使用反褶积方法来标准化scRNA-seq矩阵。耗竭的亚群1有最多的个实质性代谢通路活性，包括氧化磷酸化、糖酵解/糖异生和柠檬酸循环(TCA循环)。在耗竭的亚群2中，组氨酸和酪氨酸代谢显著上调。脂肪酸生物合成诱导的细胞毒亚群3的活性最高。苯基丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成以及葡聚糖生物合成-硫酸角蛋白分别在naive /memory亚群和细胞毒性亚群1中显著上调。进一步分析代谢途径活性分布表明，筋疲力尽的亚群1的活性最高。GSEA的结果显示在精疲力竭亚群1中氧化磷酸化和糖酵解/糖异生的活性高，这与通路活性分析一致(图3E)。然而，只有氧化磷酸化在耗竭亚群2中高度升高。此外，在细胞毒亚群3中观察到氧化磷酸化和TCA周期的上调。作者还对代谢基因进行主成分分析(PCA)，以确定主成分(PCs)在不同亚群体中的方差。
图3.CD8 + T细胞亚群GO、KEGG分析
为了进一步表征不同亚群体的异质性，还利用标记基因、PD-1和CTLA-4信号通路进行通路活性和GSEA分析。与上述代谢分析相似，在耗尽亚群1中，几乎所有的标记通路都普遍上调。一个更合理的解释是，在耗尽亚种群1中可能出现代谢和标记活性异常。值得注意的是，两个衰竭亚群都具有高的上皮-间充质转化活性和Notch信号。还发现免疫检查点通路、PD-1和CTLA-4信号通路245在每个细胞亚群中均上调(图4C)。重要的是，免疫检查点通路最高活性主要富集于细胞毒亚群2、细胞毒3亚群、耗尽亚群1和耗尽亚群2。这些结果表明，封锁免疫检查点可能有助于促进CD8 + T细胞的抗肿瘤免疫应答。这些结果也可以解释耗尽亚群不良预后的影响。此外，hallmark氧化磷酸化在耗尽的亚群1中显示出高预证明活性上调，而γ253干扰素应答能力在所有亚群中均升高。
图4.标记基因、PD-1和CTLA-4信号通路进行通路活性和GSEA分析
缺氧是一种环境因素，对其他途径有重要影响。因此探讨了缺氧与代谢和标志通路的关系,结果是氧化磷酸化、糖酵解/糖异生和TCA循环与缺氧呈正相关。值得注意的是，作者发现消亡和p53通路与缺氧表现出最强的正相关。缺氧与PD-1和CTLA-4信号通路存在微弱的正相关。这项结果表明，不同CD8 + T细胞亚群的通路活性存在异质性，这可能与SKCM的不同预后相关。此外，缺氧也干扰了CD8 + T细胞亚群的某些通路活性。
4 时间轨迹显示免疫检查点的动态变化
作者采用拟时间轨迹来探索CD8 + T细胞的分化程序是否有助于异质性预后。如图5A所示，用t-SNE对伪时间微分程序进行可视化。在CD8 + T细胞分化过程中，作者发现以下轨迹:初始/记忆型CD8 + T细胞倾向于转化为枯竭亚群2(谱系1)或细胞毒性271亚群1(谱系2)(图5A)。该结果可能解释了为什么高比例的耗竭亚群2会导致不良预后。证明耗尽亚群2，可能是亚群的一个终末状态，并显示低细胞毒性和高免疫检查点活性。此外，通路活性异常的耗竭亚群1 可能是分化至耗竭亚群2的中间状态。
图5.时间轨迹中的CD8 + T细胞的分化程序
在谱系1中,细胞毒性标志(PRF1, GZMA GZMK, NKG7) 将上调过程中,初始/记忆CD8 + T细胞分化、细胞毒性亚群3,然后这些标志往往是下调直到衰竭亚群2中。在免疫检查点(PDCD1, 283 TIM-3/HAVCR2和LAG3)和共刺激分子(CD27)中观察到类似的趋势。衰竭亚群标志信号(CTLA4、TIGIT、TNFRSF9)和增效点CD7呈上升趋势。其他免疫检查点(CD244, 286 TMIGD2, CD226, KLRG1)在谱系中均未显示随时间的动态进化。在谱系2中，PRF1、GZMA和NKG7总体呈上升趋势，而GZMK呈下降趋势。几乎所有的抑制检查点在谱系2过程中都被下调，除了TIM-3/HAVCR2、TIGIT和协同检查点CD7。结果阐明了黑色素瘤中CD8+ T细胞的伪时间轨迹以及免疫检查点的时间依赖性变化。
5 CD8 + T细胞亚群的
异质性相互作用对和转录因子
考虑到不同的CD8 + T细胞亚群的异质性，分析关键的配体-受体对和主导相互作用的细胞亚群。发现耗竭的CD8 + T细胞亚群1在交互配对中起主导作用。在不同的CD8 + T细胞亚群中有83对显著的配体-受体。频率最高的5对配体受体分别是CCL5_CCR5、CD74_MIF、301 CD74_COPA、CCL4_CCR5和HLA−E_KLRK1(图6C)。热图显示了前50位频率最高的配体-受体对的具体分布。这对配体-受体主要在耗尽的CD8 + T细胞亚群1中相互作用，表明其与其他亚群的重要作用。因此，耗尽的CD8 + T细胞亚群1可能有高度的功能障碍。
图6.294个关键的配体-受体对和相互作用的细胞亚群
一项先前报道的研究已经确定转录因子(TFs)可以塑造T细胞表型并调节基因表达。因此，作者使用SCIENIC来探索CD8 + T细胞亚群潜在的差异TFs。作者发现在特定的亚群中有TFs表达，如初始/记忆亚群中KLF6、FOS、FOSB、JUNB、CREM的高表达(图6D)。此外，在耗尽亚种群1和耗尽亚种群313 2中分别观察到STAT1 312和CREM(图6D)。STAT1和POLR2A(该基因编码RNA聚合酶II复合物)在细胞毒亚群3中均上调，而在细胞毒亚群2中POLR2A的315活性更高(图6D)。TFs分析结果可能揭示，在naive /memory亚群中多个TFs的高活性为初始分化提供了必要的调控。总的来说，这些分析鉴定了个优势亚群(耗尽CD8 + T细胞亚群1)，频繁的配体受体对，以及CD8 + T细胞亚群的差异调节TFs。
6 PMEL、TYRP1和EDNRB是新的治疗靶点
考虑到高比例的亚群2导致SKCM的不良预后，作者分析了这个亚群中最高表达的基因，以筛选出潜在的治疗靶点(图7A)。然后，进行Kaplan-Meier生存分析，探讨筛选基因的预后价值。最后，作者筛选出PMEL、TYRP1和EDNRB，它们可能是新的靶点，它们的高活性与SKCM的预后不良显著相关。值得注意的是，PMEL、TYRP1和EDNRB仅在耗尽亚群2中高表达，表明它们在预后中扮演着重要的角色。此外，这三个基因在SKCM的bulk RNA-seq 样品中也表现出较高的活性。作者还探讨了PMEL、TYRP1和EDNRB 在不同病理阶段是否存在动态表达。结果表明，只有TYRP1可能参与了SKCM的进展。
图7.PMEL、TYRP1和EDNRB治疗靶点相关分析
接下来，作者通过FIREBROWSE数据库在不同的肿瘤中研究了新靶点的转录水平。所有的新靶点在SKCM和葡萄膜黑色素瘤(UVM)中变异最高，揭示了新靶点和黑色素瘤之间的紧密联系(图7E)。考虑到340个特异性高表达的新靶点在黑色素瘤样本和亚群2中，作者探究了不同的scna -seq数据在黑色素瘤肿瘤微环境中的T细胞和CD8 + T 细胞是否也具有这种特性。因此，作者获得了T细胞的单细胞数据，这些数据聚类良好，以验证作者的结果的准确性。与以上结果一致，作者观察到PMEL和TYRP1在一个CD8 + T细胞簇中高表达，而在某个CD4 + T细胞簇中不高表达。然而，作者并没有在特定的CD8 + T细胞簇中观察到EDNRB的高表达。这可能是由于细胞丰度较低，集群3中只有263个CD8 + T细胞，而耗尽亚群2中有1971个CD8 + T细胞(图1F)。总之，作者发现PMEL、TYRP1和EDNRB与黑色素瘤密切相关，它们将导致不良的临床结果，并可能成为新的治疗靶点。
三、小结
作者通过收集的黑色素瘤scRNA-seq数据，分析了CD8 + T细胞亚群在预后中的具体作用，探索异质性来源，确定了7个主要亚群。耗竭型CD8 + T细胞亚群2的高浸润会导致不良的预后，大部分初始/记忆细胞和细胞毒性CD8 +T细胞亚群3将导致有利的预后。通过鉴定的三个过表达的基因（PMEL，TYRP1，EDNRB）与不良预后显着相关，仅在耗竭型的CD8 + T细胞亚群2中表达。通过解释的黑色素瘤中的CD8 + T细胞亚群，确定了免疫抑制检查点的基因PMEL，TYRP1，EDNRB可以作为黑色素瘤治疗的潜在靶标。
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