BrdU掺入实验原理及步骤

溴脱氧尿嘧啶核苷是DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物，通过竞争掺入S期细胞单链DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶。BrdU与胸腺嘧啶竞争掺入的强溴脱氧尿嘧啶核苷是DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物，通过竞争掺入S期细胞单链DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶。BrdU与胸腺嘧啶竞争掺入的强度可能与细胞增殖异常有关，如肝癌细胞约11.6%的胸腺嘧啶被替代，而正常肝细胞仅有1.1%。

既往在分子遗传学等研究中常采用同位素标记，但有放射污染，技术难度大，实验周期长等缺点。近年来非放射性标记物的研究发展迅速，然而其敏感性多数不及同位素，使实验应用受限。自82年Gratzer制备出抗BrdU单抗及标记检测技术不断改良提高，应用BrdU标记的敏感性已与氘胸腺嘧啶核苷相似。目前认为BrdU是最有希望取代同位素的非放射性标记物之一。

详细步骤：

第1天

1. 用100μM的BrdU工作液（用5mg/ml的储存液以6μL/mL稀释而成）标记细胞。 胚胎干细胞，30分钟 ；3T3细胞，2.5小时 ；二倍体成纤维细胞，4－6小时。

2. 胰酶消化细胞，用PBS洗脱，400×g或1700rpm离心5分钟，去上清，加入10 mL 70% EtOH重悬。

3. 保存在－20℃过夜或数天。

第2天

1. 将第一天的标本离心去上清，并用洗涤缓冲液（PBS + 0.5% IFS）洗涤。

2. 离心去上清，以0.5 mL 2M HCl + 0.5% IFS （Keratin intermediate filaments (IFs)必须新鲜配制！），室温孵育20分钟。

3. 加入1ml洗涤缓冲液洗涤细胞。

4. 离心去上清，以0.1M的四硼酸钠（Na2B4O7）重悬细胞，室温孵育2分钟。

5. 用1ml洗涤缓冲液洗涤细胞2次（分出一部分细胞用于PI单染，见第10步）

6. 用50μL洗涤缓冲液重悬细胞，加入anti-BrdU抗体，4℃孵育20分钟。

7. 加入1.5ml洗涤缓冲液洗一次。

8. 用50μL洗涤缓冲液重悬细胞，加入用于封闭Fc段的抗体（如FITC-conjugated rabbit anti-mouse (F(ab')2 fragments等），4℃孵育20分钟。

9. 加入1.5ml洗涤缓冲液洗涤一次。

10. 以0.3ml PI（10μg/ml）重悬细胞，室温孵育30分钟。准备上机。