Crispr/Cas9慢病毒包装构建流程

Cas9蛋白的CDS长达4kb，克隆难度和包毒难度都相对大，将Cas9基因高效导入细胞是应用Cas9/CRISPR系统进行基因敲除的难点之一，极大地限制可供选择的将基因导入细胞的方法。并且在用CRISPR/Cas9系统进行基因敲除时，还需要同时转入识别靶点的gRNA，筛选阳性细胞的抗性基因或荧光基因，用同源重组法进行基因敲除，还需要导入同源重组模板。如此多的基因共同表达，很难得到较高的基因编辑效率，造成后续的阳性克隆筛选和检测工作难度大。

Crispr/Cas9慢病毒特点

a、适用于在同一个细胞系中需要进行多个基因敲除的实验；

b、基因敲除效率比直接质粒转染更高；

c、提供多种不同荧光和抗性标记的慢病毒表达载体，更易筛选到基因敲除成功细胞；

d、接受cas9蛋白稳定表达不同细胞系定制。

Crispr/Cas9慢病毒流程

A、cas9载体构建及慢病毒包装

将cas9基因CDS区克隆至慢病毒载体，并进行cas9慢病毒包装。

B、稳定株筛选

将cas9慢病毒感染特定的目的细胞，进行cas9稳定表达的细胞株筛选。