科研 | 长期饮用咖啡的女性代谢组学特征及其患2型糖尿病的风险
编译：孙元芳，编辑：Emma、江舜尧。
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咖啡是世界上最流行的饮料之一。越来越多的证据表明，长期饮用咖啡可以降低患各种慢性疾病的风险，尤其是2型糖尿病。因此，2015-2020年美国膳食指南建议将适量饮用咖啡作为健康饮食模式的一部分。然而咖啡预防2型糖尿病的机制尚不清晰。我们利用两大组女性的饮食和代谢组学数据，确定并验证了1595名女性的血浆代谢物与咖啡摄入有关。然后，我们在两个嵌套的病例对照研究（n=5457例和1371例对照组）中评估了咖啡相关代谢物与糖尿病风险的潜在关联性以及这些代谢物对糖尿病的附加预测性。在461种代谢物中，34种被鉴定和证实与咖啡总摄入量有关，包括13种正相关（主要是胡卢巴碱、多酚代谢物和咖啡因代谢物）和21种反向关联（主要是三酰甘油和二酰甘油）。除了咖啡因及其代谢物只与咖啡因咖啡的摄入量有关外，这些联系对于含咖啡因和不含咖啡因的咖啡来说是一致的。与咖啡摄入量呈正相关的3种胆固醇酯与糖尿病风险呈负相关，而与咖啡呈负相关的12种代谢物（5个二酰甘油和7个三酰甘油）与糖尿病呈正相关。将15种糖尿病相关代谢物加入经典的基于危险因素的预测模型中，C统计量从0.79（95%CI 0.76，0.83）增加到0.83（95%CI 0.80，0.86）（P<0.001）。本研究表明咖啡摄入与全局代谢变化有关，其中脂质代谢产物可能是咖啡抗糖尿病的关键。咖啡相关的代谢物可能有助于改善糖尿病的预测。
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实验设计
1. 研究设计与人群
1976年，英国国民保健服务局（NHS）招收了121700名30-55岁的女护士，1989年国家卫生保健局（NHSII）招收了116429名25-42岁的女护士。通过邮寄的调查问卷每两年进行一次，以评估生活方式和病史，两组每个周期的随访率均超过90%。1989-1990年收集了NHS的32826名女性的血液，1969-1999年收集了NHSII 的29611名女性的血液。提供血样的妇女的饮食和生活方式与不提供血样的妇女相似。样本加冰袋连夜寄回实验室，95%的样本在抽血后24小时内到达。到达后，立即将样本离心并以血浆、血沉棕黄层和红血球等形式放入低温管中，并储存在液氮冰箱中。
研究分为两个阶段。首先，我们进行了横断面分析，以确定和验证咖啡相关的代谢物。我们抽取了队列中已有可用血浆代谢组学数据的女性作为参与者。在排除了抽血前有糖尿病、心血管疾病或癌症病史或咖啡摄入或代谢物数据缺失的参与者后，共有949名女性(427种指定代谢物)和646名女性(413种代谢物)分别被纳入发现组和验证组。然后，我们进行了一项嵌套的1:3配对的病例对照研究(207例病例和621例对照对象)，前瞻性地评估了与咖啡摄入相关的代谢物与2型糖尿病的风险之间的关系。我们使用已识别的代谢产物开发了糖尿病预测模型，并在另一项病例对照研究(250例和750例对照对象)中验证了其性能。简单地说，在具有可用代谢组学数据的参与者中，我们确定了抽血后至随访结束（NHS，2012年6月30日，NHSII，2013年6月30日）的糖尿病事件案例。采用风险集抽样方法，我们为每名糖尿病患者随机选择三名对照受试者，这些受试者在被诊断为病例受试者时是活着且没有糖尿病的，而且采血时的年龄、研究队列（NHS、NHSII）和禁食状态相匹配。研究方案已获百翰女子医院机构评审委员会及哈佛大学陈公学人文学科委员会评审委员会批准。
2. 膳食评估
每4年进行一次经验证的131项食物频率问卷（FFQ）以收集最新的饮食数据。调查对象被问及他们在过去一年里平均吃一种食物的频率(从每月不吃一次或少于一次到每天吃六次或更多)。对于咖啡，调查问卷询问了在8盎司（237毫升）的杯子中分别饮用含咖啡因和不含咖啡因咖啡的频率。我们把这两种咖啡的总消费量算作这两种咖啡的总和。FFQs的有效性和可重复性之前已经被报道过，FFQs评估的咖啡消费与4个1周饮食记录之间存在高度相关性(r=0.78)。在当前的研究中，为了获取与代谢物水平最相关的日常饮食摄入量，并减少人体内的变异性，我们计算了最接近抽血时间的两种FFQ的平均摄入量（即，1986年和1990年为NHS，1995年和1999年为NHSII）。在我们的研究小组中，每个FFQ周期中咖啡摄入量的分布被证明是高度稳定的。
3. 代谢组学分析
如前所述，研究中使用的所有代谢组学数据都是在Broad研究所使用液相色谱串联质谱(LC-MS)生成的。简而言之，高分辨率、准确的质量分析数据是通过LC-MS系统获得的，该系统由Nexera X2 UHPLC系统(Shimadzu Corp.， Marlborough, MA)和Q Exactive或Exactive PlusOrbitrap质谱仪(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)组成。极性代谢物采用亲水性相互作用液相色谱-正离子模式质谱检测分离，中间极性代谢物采用负离子模式检测C18层析和正离子模式检测C8层析分离。使用TraceFinder 3.3软件(Thermo FisherScientific)和ProgenesisQI(Nonlinear Dynamics, Newcastle upon Tyne, U.K.)处理原始数据。对于每一种方法，代谢物的身份是通过使用真实的参考标准或参考样品来确认的。为了评估代谢组学分析的时间漂移，混合的参考血浆样本被分散，每隔20个参与者样本进行分析。在每个子研究中，我们去除了未命名的代谢物、没有人与人之间差异的代谢物，以及漂移参考样品之间平均变异系数为0.25%或组内相关系数为0.40的代谢物。代谢物包括10%缺失量，每种代谢物的缺失数据用最小测量值的一半进行估算。最后共有427种代谢物被纳入分析。
4. 统计分析
为了考虑批次效应和改善正态性，在每个亚研究中，代谢物测量值进行了自然对数转换，并使用z分数(来自平均值的SDs)进行标准化。在第一阶段分析中，在调整了潜在的混杂因素后，我们使用线性回归来检查咖啡摄入量与每个代谢物之间的联系。结果以每增加1杯咖啡的代谢物水平的百分比差表示，使用以下指数函数：[exp (b-coefficient)-1]×100%。我们将总咖啡摄入量作为主要暴露量，并分别在发现和验证组中进行分析。在二级分析中，我们在混合样本中分别检测了含咖啡因和不含咖啡因的咖啡。在源病例对照研究中，对从不吸烟者和被选为对照对象的参与者进行敏感性分析，以尽量减少吸烟造成的混淆。在II期分析中，我们使用条件logistic回归计算了咖啡相关代谢物（SD每增加1）和糖尿病风险之间的优势比（ORs）和95%可信区间。我们调整了糖尿病家族史以及I期分析中包括的其他协变量。我们还对咖啡相关代谢物进行了主成分分析(PCA)，并检查了与糖尿病风险相关的前两种成分得分。为了评估咖啡相关代谢物对糖尿病的预测能力，我们使用受试者操作特征分析计算了C-统计量。我们考虑了三个模型：模型1，基于已确定的风险因素，包括年龄、体重指数、体力活动、吸烟和糖尿病家族史；模型2，基于当前研究中与糖尿病风险相关的咖啡相关代谢物；模型3，基于既有因素和代谢物的组合。使用非参数方法比较这些模型之间的C-统计量。此外，我们计算了综合判别改进和净重分类改进来评估代谢物的附加预测能力。
所有分析均采用R3.2.5（奥地利维也纳R统计计算基金会）和SAS 9.4版（SAS研究所，北卡罗来纳州卡里）进行。所有的统计检验都是双面的。我们计算了错误发现率（FDR）以校正多重测试的显著性水平为α=0.05。
实验结果
1. 咖啡相关代谢物的鉴定
表1显示了根据总咖啡消费频率的研究参与者的基本特征。参与发现（n=949）和验证（n=646）子集的参与者具有相似的特征。喝咖啡的人更有可能是现在的吸烟者。
在发现阶段，经过多次测试校正后，427种代谢物中有73种与总咖啡摄入量相关(FDR P值小于0.05)。在73种代谢物中，有10种在验证阶段无效。在剩下的63种代谢物中，34种被证实与咖啡摄入量有关（表2），其中13种与咖啡总摄入量呈正相关，包括葫芦巴碱、咖啡因及其代谢物（5-乙酰氨基-6-氨基-3-甲基尿嘧啶[AAMU]、1,7-二甲基尿酸和7-甲基黄嘌呤），多酚代谢物（肉桂酰甘氨酸和4-羟基马尿酸）、苯乳酸、胞嘧啶、L-肉碱和三种胆固醇酯（CEs）。另外21种代谢物与咖啡总摄入量呈负相关，主要是三酰基甘油(TAGs)和二酰基甘油(DAGs)。对34种代谢产物的相关分析表明，大多数类脂物质呈正相关，同一类或共有脂肪酸链的代谢产物趋向于聚集在一起。
34种被鉴定的代谢物中，大多数与含咖啡因和不含咖啡因的咖啡具有一致的相关性，但咖啡因及其代谢物仅与含咖啡因咖啡有关（表2）。当我们将分析限制在不吸烟者或原始病例对照研究的对照参与者时，咖啡代谢物的相关性基本保持不变。
表1 根据咖啡总消费量的NHS和NHSII研究参与者的基线特征
表2 根据NHS和NHSII参与者的咖啡消费量，34种经验证的代谢物的百分比差异（95%CI）
2. 咖啡相关代谢物与糖尿病风险的关系
在训练数据集中，每1杯/天增加的总咖啡消耗量的多变量校正OR为0.95（95%CI 0.82，1.09），验证集为0.93（95%CI 0.83，1.03），联合分析为0.95（95%CI 0.89，1.02）。在34种咖啡相关代谢物中，30种可用于糖尿病分析。肉桂酰甘氨酸、苯乳酸、二十二碳六烯酸、C52:5 TAG由于缺失率高（＞50%）不可用于糖尿病分析。如表3所示，在对潜在混杂因素进行调整和多重试验校正后，与咖啡摄入量呈正相关的三种代谢物与糖尿病风险呈负相关（C18:1 CE、C20:4 CE和C18:2 CE），SD每增加1，调整后的ORs为0.59-0.61。相比之下，12种与咖啡呈负相关的代谢物与糖尿病呈正相关，包括5个DAGs和7个TAGs，SD每增加1，调整后的ORs为1.35-2.06。在15种与糖尿病相关的代谢物中，14种在验证病例对照组中可用，并显示出与糖尿病的一致相关性。
对30种咖啡相关代谢物的PCA分析表明，前三个主成分分别占总变异量的44.9%、15.1%和10.3%。第一主成分是DAGs和TAG的混合，与糖尿病风险呈正相关（或每增加1.15个成分得分[95%CI 1.08,1.22]），第二个主成分主要代表CEs，与糖尿病风险呈负相关（OR 0.80[95%CI0.71,0.89]），第三个主成分是咖啡因及其代谢物，与糖尿病无关（OR 0.96[95%CI0.86,1.08]）。
对于糖尿病预测分析（图1），我们使用15种糖尿病相关代谢物和使用经典危险因素得到了类似的C-统计量。将代谢物添加到经典风险因素模型中，在训练集中，C-统计量从0.79（95%CI 0.76，0.83）增加到0.83（95%CI 0.80，0.86）（P，0.001），在验证集中从0.75（95%CI 0.72，0.78）增加到0.78（95%CI 0.75，0.82）（P，0.001）。在将咖啡消费量加入模型后，C -统计量数据基本没有变化。在个体代谢物中，C50:2 TAG和C34:1 DAG在训练集（均为0.74）和验证集（分别为0.68和0.69）中显示出最高的C-统计量。与仅包含经典风险因素的模型相比，结合经典因子和代谢物的模型（训练集，62.2%[95%CI 47.2，77.1]和验证集，47.7%[95%CI 33.8，61.7]）观察到更高的净重分类改善，具有统计学意义（P＜0.0001）。同样，我们发现结合经典因子和代谢物的模型的综合判别改善（P＜0.0001）在统计学上有显著改善。
表3 NHS和NHSII中咖啡相关代谢物与2型糖尿病风险的关系
图1 基于经典因素（包括年龄、体重指数、体力活动、吸烟和糖尿病家族史）、与2型糖尿病风险相关的15（A）或14（B）血浆基质，以及训练集（A）和验证集（B）中经典因子和代谢物的组合，预测模型的C-统计量（95%CIs）。
A：联合模型与经典因子模型的P＜0.001，代谢物模型与经典因子模型的P=0.35。B：联合模型与经典因子模型的P＜0.001，代谢物模型与经典因子模型的P=0.23。
结论
利用两大组女性的综合膳食和代谢组学数据，我们确定并验证了34种与咖啡摄入量相关的血浆代谢物。这些代谢物可分为两类：咖啡摄入量的内暴露标志物（葫芦巴碱、多酚代谢物、咖啡因及其代谢物）和长期饮用咖啡后的代谢反应，如脂质代谢产物。将这些代谢物与糖尿病风险联系起来，我们发现3种与咖啡摄入量呈正相关的CEs与较低的糖尿病风险相关，而与咖啡呈负相关的12种脂质代谢物（DAGs和TAGs）与较高的糖尿病风险相关。此外，受试者操作特性分析表明，咖啡相关代谢物可能有助于改善糖尿病的预测，而不仅仅是确定的危险因素。这些发现为咖啡对健康的益处提供了新的见解，并提示了咖啡相关代谢物在改善糖尿病预测方面的潜力。
一项对18项前瞻性队列研究的荟萃分析显示，每天饮用1杯咖啡，患糖尿病的风险降低7%。此外，我们之前在NHS和NHSII的发现都支持含咖啡因和不含咖啡因的咖啡对糖尿病都有好处。在目前的研究中，我们发现咖啡摄入量和糖尿病风险之间有相似的反向关系，尽管95%的顺式脂肪酸含有一种，可能是由于样本量不大。此外，我们还发现，在联合训练和验证数据集中，高浓度的胡芦巴碱（一种公认的饮用咖啡标志物）与较低的糖尿病风险相关（OR 0.88[95%CI0.77,0.99]）。
众所周知，咖啡会影响脂质代谢，但对其生物标记和具体途径仍知之甚少。在我们的研究中，大多数被测代谢物是脂类，包括CEs、DAGs、TAGs、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺（LPE），因此我们能够识别与长期咖啡摄入相关的特定脂质代谢产物。我们观察到咖啡摄入量与三种CEs呈正相关(C20:4 CE, C18:1 CE和C18:2 CE)，与21种脂质(主要是DAGs和TAGs)呈负相关。一些观察性研究已经报道了咖啡摄入量和标签浓度之间的负相关关系，支持了我们的研究结果。实验证据表明，咖啡多酚(如绿原酸)显著降低血浆游离脂肪酸、甘油三酯和总胆固醇浓度，部分是通过抑制胆固醇合成和刺激肝脏中脂肪酸β氧化活性。这也许可以解释我们发现的咖啡摄入量与DAGs 和TAGs的负相关关系。
高血浆TAG浓度和低HDL胆固醇与糖尿病风险增加有关，而血脂异常可能是由胰岛素抵抗引起的游离脂肪酸流量增加引起的。我们发现，与咖啡摄入量呈负相关的DAGs和TAGs与糖尿病高风险相关。与我们的研究结果一致，两项前瞻性队列研究发现，调整TAGs可以减弱咖啡摄入量与糖尿病风险之间的关联。另一方面，CEs与咖啡呈正相关，与糖尿病风险呈负相关。其他研究也报道了类似的发现。CEs主要存在于血浆脂蛋白中，特别是HDL，它将多余的胆固醇从外周组织输送到肝脏进行排泄。咖啡的摄入有可能通过提高CE和HDL水平来降低糖尿病风险。事实上，一项临床试验显示，连续3个月每天饮用48杯咖啡后，血清高密度脂蛋白胆固醇显著升高。另外，我们观察到的咖啡和脂质代谢产物之间的联系可能代表胰岛素抵抗的非因果效应，胰岛素抵抗是糖尿病的直接原因。
与之前的研究一致，我们发现总的和含咖啡因的咖啡摄入量与咖啡因和三种咖啡因代谢物（包括AAMU、1,7-二甲基尿酸和7-甲基黄嘌呤）之间有很强的相关性。在妇女健康倡议组织最近的一项研究中，这四种代谢物都与饮食中较低的炎症潜能有关，与咖啡的抗炎作用密切相关。咖啡因代谢的主要途径是肝脏中的CYP1A2和CYP2A6，在催化生成AAMU、1,7-二甲基尿酸和7-甲基黄嘌呤之前，通过N-3-脱甲基生成副黄嘌呤。关于咖啡因在糖尿病发展中的作用，虽然短期的人体研究表明，摄入含咖啡因的咖啡可能会导致胰岛素敏感性的急性降低，但一项对28项前瞻性研究的Meta分析发现，摄入含咖啡因和不含咖啡因的咖啡都会降低患糖尿病的风险。我们先前的研究还发现，摄入含咖啡因和不含咖啡因的咖啡都与关键代谢和炎症途径中各种生物标志物的良好分布有关。这些结果与我们目前观察到的咖啡因和咖啡因代谢物与糖尿病风险无关的观察结果是一致的，这表明咖啡中除咖啡因以外的其他成分可能对糖尿病产生有益影响。
咖啡中富含多酚类物质。我们鉴定出两种与咖啡有关的代谢物，肉桂酰甘氨酸和4-羟基马尿酸，均是微生物代谢多酚类物质时产生的。人类肠道中含有多种微生物。在这些代谢产物在全身循环中进行进一步代谢之前，特定的细菌酶可以通过脱糖基化、脱羟基化和去甲基化将多酚转化为更小的代谢物。肉桂酰甘氨酸是肉桂酸的甘氨酸结合物，肉桂酸是多酚类物质的肠道微生物代谢物；4-羟基马尿酸是多酚代谢的另一种微生物产物，由4-羟基苯甲酸与甘氨酸在肝脏结合生成。与我们的研究一致，已有报道证明这些代谢物与富含多酚类物质（包括咖啡）的高消耗有关。但是据我们所知，之前没有研究评估这些多酚代谢物与糖尿病风险的关系。在我们的病例对照研究中，只检测到4-羟基马尿酸，而且它与糖尿病风险无关。需要进一步的研究来进一步检查多酚代谢产物与糖尿病风险之间的关系。
本研究有几个优点：包括大样本量，在抽血前对含咖啡因和不含咖啡因咖啡的摄入量进行重复评估，为混杂控制收集详细的协变量数据，以及分析广泛生化化合物的多代谢组学方法。此外，我们在一个实验室中使用来自同一来源队列和相同代谢组平台的样本，对咖啡代谢物及其与糖尿病风险的关系进行了内部验证。但是该研究也有一些局限性。首先，可能存在与FFQ饮食评估相关的测量误差。然而，我们队列中使用的FFQ已经被验证用于评估长期咖啡摄入量。其次，我们没有关于咖啡豆类型、烘焙和制备方法的信息，也没有咖啡中添加糖/奶油的量，这些信息可能会影响对咖啡消费的代谢反应。例如，与未经过滤的咖啡相比，过滤后的咖啡含有更少的脂质。在我们队列的随访期间，大多数在美国摄入的咖啡是过滤咖啡。所以，我们的研究结果是否适用于未经过滤的咖啡，需要在未来的研究中加以检验。第三，我们的研究是观察性的，无法建立因果关系。然而，我们进行了严格的多变量调整，以尽量减少残余混杂的影响。同时，我们的观察也得到了生物学证据的支持。第四，代谢组分析只进行了一次。然而，我们对1-2年的重复评估的初步研究表明，大多数代谢物的水平随着时间的推移高度稳定（组内相关系数或Spearman相关系数＞0.65）。第五，识别出的类脂种类相互关联，很难将它们与咖啡摄入量和糖尿病风险的独立联系弄清楚。最后，我们研究的参与者都是女性，主要是白人，这限制了我们研究结果的概括性。男子和其他种族/族裔群体需要进一步确认。
总之，本研究鉴定了一组34种与咖啡摄入量相关的血浆代谢物。本研究为假说：咖啡可以通过调节脂质代谢来降低糖尿病风险，咖啡相关的代谢物可以在传统的危险因素之外提高对糖尿病风险的预测，提供了证据。未来的前瞻性和介入性研究需要证实我们的发现。