科研| mBio：水稻稻瘟病之代谢组学水平的研究(国人佳作)
编译：寒江雪，编辑：谢衣、江舜尧。
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稻瘟病菌附着胞通过破裂角质层侵染进入水稻叶片组织。但是这一过程是如何完成的，目前还没有完全弄清楚。本研究发现：
1) 通过非靶向代谢组学对孢子发育各个阶段的关键代谢物及代谢途径进行分析，确定了6条显著变化的关键代谢途径。
2) 使用小分子抑制剂、基因敲除及遗传和化学回补的分析表明，鞘脂生物合成途径中神经酰胺是有丝分裂调控附着胞正常发育所必需的物质。
3) 在稻瘟病的附着胞复极化和致病过程中，神经酰胺作用于蛋白激酶C介导的细胞壁完整性途径的上游。
4) 鞘磷脂生物合成途径分析发现，神经酰胺合成的葡萄糖神经酰胺(GlcCer)是影响稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）致病性的关键物质。
本研究的结果提供了对感染相关信号网络中涉及的化学成分的新见解，从而揭示了开发新的防治水稻和其他谷物主要病害的药物的潜在靶点。
论文ID
原名：Metabolomics Analysis Identifies Sphingolipids as Key Signaling Moieties in Appressorium Morphogenesis and Function in Magnaporthe oryzae
译名：代谢组学分析确定鞘磷脂是稻瘟病菌附着胞发育和功能的关键信号元件
期刊：mBio
IF：6.747
发表时间：2019.08
通讯作者：林福呈
作者单位：浙江大学生物技术研究所
实验设计
实验材料： M. oryzae野生型菌株（Guy11）的附着胞形成过程中的0h、6h、12h、18h、24h、36h和48h的样本。
测序策略：GC-MS和LC-MS非靶向代谢组分析。
研究内容：通过对不同时间点附着胞代谢组学分析，分析显著变化的通路。通过小分子抑制剂、遗传析和化学回补分析，确定了鞘脂是稻瘟病菌附着胞发育和致病的关键信号元件。
实验结果
1附着胞的代谢物分析
根据之前的研究，分别收集附着胞发育的7个时间点（0h、6h、12h、18h、24h、36h和48h）的样本。0h为未萌发的孢子，6-12h形成早期附着胞，12-24h形成成熟附着胞。为了更好地了解成熟的附着胞，研究人员将培养时间延长到48小时（图1a）。通过气相色谱-质谱(GC-MS)和液相色谱-质谱(LC-MS)分析共得到10344个离子信号(LC-MS 9631个，GC-MS 713个)。主成分分析(PCA)发现42个样本(7个时间点中每个6个重复)被聚为7组，突出了不同时间点代谢表型的显著变化。GC-MS数据中总共鉴定了110种代谢物，LC-MS通过标准品匹配到29种代谢物。
分析不同发育阶段的代谢物的变化，与0h（孢子未萌发）相比，24h的代谢谱差异最显著，说明在24h是孢子萌发感染过程的关键点（图1b）。对0h和24h两组数据进行差异分析，GC-MS有29个差异代谢物，LC-MS平台共鉴定出713个差异离子信号，通过标准品匹配到29种差异代谢物（图1c）。对差异代谢物进行KEGG富集分析发现在脂质降解、碳水化合物降解、精氨酸合成、鞘脂合成、固醇合成和磷脂代谢等途径显著变化（图2a）。
2附着胞发育过程中能量、甾醇和鞘磷脂代谢的显著变化
差异积累的代谢物为附着胞发育和功能生物学研究提供了见解。例如，当检测到谷甾醇及其前体代谢物的积累时，附着胞形成期间的上述7个时间点的真菌甾醇(麦角甾醇)水平没有发现明显的变化（图2b）。可能是由于外源植物甾醇诱导了α-1，3葡聚糖在M.oryzae细胞壁中积累，促进其在寄主组织中的定殖。
鞘脂类物质合成途径中的中间产物（鞘氨酸、植物鞘氨醇、二氢神经酰胺和神经酰胺）在孢子形成过程中有明显变化（图2c）。未萌发的分生孢子（0 h）和萌发早期（6 h）中神经酰胺的含量极低。随着孢子逐渐成熟（12h、18h、24h）神经酰胺开始大量积累。在24h达到峰值后，随着时间增加（24h、36h和48 h）神经酰胺水平迅速下降，而在48 h后则无法检测到神经酰胺（图2d）。研究人员得出结论，与神经酰胺生物合成途径相关的代谢物在附着胞形态形成前期特异积累，并在成熟期代谢消耗。
3早期鞘脂生物合成的化学抑制
因为人们对鞘脂类物质在真菌中的作用知之甚少，研究人员进一步对鞘脂通路的早期中间产物在稻瘟病中的作用进行研究。通过使用鞘氨醇生物合成过程中的关键酶（即丝氨酸棕榈酸转移酶）对孢子进行化学抑制。用不同浓度的多球壳菌素处理野生型M.oryzae（Guy11），该处理对分生孢子没有影响，但是严重影响附着胞的形态，导致形成三种不同成熟状态的形态类型（图3a和b）。同样，用鞘氨醇N-酰基转移酶抑制剂伏马菌素B1(FB1)处理也出现高度相似的三种缺陷/形态类型（图3d）。
研究人员以大麦和水稻的离体叶片为材料，详细分析了这些神经酰胺合成抑制剂对M.oryzae致病性的影响。接种未经处理的M.oryzae的孢子悬液的叶片表现出典型的稻瘟病症状，而接种抑制剂处理的分生孢子的叶片几乎没有坏死病变。研究不同浓度多球壳菌素和FB1处理对M.oryzae致病力的影响（图3c和e）。伤后24h（hpi）的活细胞成像显示抑制剂处理抑制了稻M.oryzae附着胞侵染钉的形成（图3f）。说明神经酰胺合成抑制剂影响附着胞的形态和侵染钉的形成，从而解释了附着胞在接触这些化学物质时无法感染宿主细胞的原因。
4鞘脂生物合成早期的基因缺失及遗传/化学回补分析
研究人员从基因水平证实化学抑制神经酰胺在稻瘟病致病性中的作用。酵母菌有6个已知编码在神经酰胺从头合成中发挥作用的酶。在M.oryzae基因组中鉴定了这六个基因的同源基因，对每个基因进行基因敲除，然而，只能获得一个水稻M.oryzae LAG1（MoLAG1；MGG_）的突变体，它在酰基辅酶A（CoA）和二氢鞘氨醇或植物鞘氨醇合成神经酰胺中起作用。其他5个基因在早期鞘脂生物合成途径的前几步发挥作用，这表明早期鞘脂代谢产物对M. oryzae细胞活力至关重要。
在研究MoLAG1在致病性中的作用之前，研究人员观察了ΔMoLAG1突变体的生长情况，发现与野生型M. oryzae（Guy 11）相比，ΔMoLAG1突变体菌丝生长受损，并且分生或无性繁殖程度显著降低（图4a）。为了评价其致病性，分别在水稻和大麦离体叶片上接种了ΔMolag1突变体的菌丝体。接种了ΔMolag1突变体的叶片上未发现稻瘟病症状，而野生型Guy11则产生坏死病变（图4b）。显微镜观察表明，即使在96hpi后该突变体的附着胞依旧不能穿透寄主表面（图4c）。
将MoLAG1基因回补到ΔMoLAG1突变体中，恢复了其所有正常表型。与Molag1互补的ΔMolag1突变体的分生孢子生长正常，表现出合适的分生孢子，能够穿透大麦或水稻叶片，并产生坏死损伤（图4a到c）。此外，研究人员还进行了化学回补实验。在培养基中添加外源神经酰胺，进一步证实由Molag1基因敲除引起的早期鞘脂生物合成中鞘脂碱基酰化的中断，确实是造成所观察到的发病缺陷的原因。未经处理的ΔMolag1菌株菌丝对大麦叶片没有造成坏死性损伤，而用100μMC2-神经酰胺处理的接种菌丝的叶子上明显可见病灶（图4d）。遗传和化学回补均能恢复突变株的致病性。说明MoLag1/神经酰胺的生物合成对稻瘟病病菌的正常生长发育至关重要。
5抑制神经酰胺的生物合成会破坏M. oryzae的细胞周期
研究人员假设由抑制剂引起的附着胞的不同程度的成熟与细胞周期调控有关。在早期8hpi时抑制剂对细胞核数量没有显著影响，而在12-24hpi，当野生型菌株Guy11的细胞核数量逐渐减少，每个附着胞只剩下一个核时，抑制剂的加入对细胞核的降解产生影响（图5a）。到24hpi时，芽孢中的细胞核仍不能进入附着胞，随后在分生孢子中降解（图5b，类型2-1），有些细胞核可以顺利进入附着胞，但分生孢子中的细胞核没有降解（图5b，类型2- 2），类型3中大部分细胞可以完成分生孢子核的降解，并且携带单个附着胞细胞核，与Guy11的分生孢子的H2B:GFP相似（图5b到d）。新核的出现表明早期鞘脂的抑制并不影响有丝分裂的间期（G1、S和G2期）和中期，但细胞核不能进入附着胞仍然表明缺少神经酰胺对M.oryzae的细胞周期产生影响。所以研究人员推断，神经酰胺控制细胞周期的后期，这对贴壁细胞的正常发育至关重要。此外，糖原和脂滴从分生孢子到附着胞的转移在所有三种形态类型中都受到神经酰胺合成抑制剂的限制。化学抑制鞘脂生物合成通过多种机制破坏附着胞的正常发育，包括细胞周期紊乱、核降解的解除调节以及大量生化和/或代谢信号传导的特殊中间产物的破坏。
6神经酰胺调节M.oryzae的PKC-CWI信号通路
神经酰胺合成抑制剂导致附着胞形成过程中的发育缺陷，说明早期鞘脂生物合成可能与稻瘟病相关的信号通路有关。附着胞形态形成过程主要涉及3个信号转导途径：cAMP-蛋白激酶A（cAMP-PKA）、雷帕霉素靶标（TOR）和蛋白激酶C介导的细胞壁完整性（PKC-CWI）途径。因此，研究人员探讨了神经酰胺与这三种信号通路之间的关系。外源性cAMP和雷帕霉素均不能抑制多球壳菌素处理引起的表型缺陷，表明神经酰胺信号传导不起到cAMP-PKA和TOR通路上游的作用。但是ΔMolag1突变株对细胞壁应激源，如十二烷基硫酸钠（SDS）、钙荧光白（CFW）和刚果红（CR）很敏感，表明神经酰胺在PKC-CWI途径中可能起作用（图6a和b）。神经酰胺信号（ΔMolag1）的缺失导致Mps1磷酸化显著降低（图6c），外源添加的神经酰胺部分恢复了ΔMolag1突变体中的Mps1磷酸化水平（图6d）。神经酰胺信号调节PKC介导的细胞壁完整性途径，它在调控稻瘟病病菌细胞周期依赖性附着胞形态形成和功能中起到重要作用。
7由神经酰胺合成的GlcCer与M.oryzae的致病性有关
到目前为止，可得出早期鞘脂（神经酰胺）通过调节细胞周期和PKC信号影响M.oryzae的致病性的结论。但是神经酰胺是葡萄糖神经酰胺(GlcCer)和肌醇磷酸化神经酰胺(IPC)的前体，这两种神经酰胺是鞘脂生物合成晚期的最终产物（图7a）。那么，ΔMolag1突变体的致病性丧失是由于缺乏GlcCer还是IPC，还是两者兼而有之？研究人员推测MoLag1可能与GlcCer的合成有关。
为了验证这一假设，研究人员通过LC-MS分析了ΔMolag1突变体中鞘脂的水平。与野生型比，ΔMolag1突变体中神经酰胺前体鞘氨酸的积累增加（图7b），而C18-二氢神经酰胺、C18-神经酰胺和C18 -OH-神经酰胺的含量显著降低。在ΔMolag1突变体中C19：2/C18的GlcCer水平也较低（图7b）。虽然野生型和ΔMolag1突变体的植物鞘氨醇，植物神经酰胺和C26-二氢神经酰胺的水平没有明显变化，但是突变体中IPC（18:0;3/26:0;0）明显缺失。说明MoLag1主要催化产生C18-CER，而C18-CER负责合成GlcCer。
接下来研究人员鉴定了M.oryzae中编码神经酰胺半乳糖基转移酶的酵母基因的同源基因(MoCGT1; MGG_10668)。获得了MoCGT1的突变体，惊讶地发现ΔMocgt1突变体的菌落形态与ΔMolag1突变体相似。ΔMoCGT1菌落生长缓慢，菌丝体稀疏（图8a）。ΔMocgt1突变体也表现出分生孢子减少，孢子总数约为野生型的1%（图8a）。ΔMocgt1突变体形成的附着胞也表现出三种不同的形态类型，这与多球壳菌素处理后结果相似。I型与Guy11相似，II型未成熟，无黑化附着壁，III型分生孢子芽孢极化生长受扰，附着胞丧失（图8b）。ΔMocgt1突变体对大麦和水稻叶片的致病力也远低于野生型（图8c）。用Guy11和ΔMocgt1突变体的分生孢子侵染大麦叶片48h后，野生型附着胞成功侵染寄主叶片的比例为74%，而ΔMocgt1突变体的附着胞只有6%能够产生穿透性附着胞并定殖在植株中（图8d）。与野生型相比ΔMocgt1突变体的膨压明显降低（图8e）。回补野生型MoCGT1基因后，恢复了转化子的生长、产孢、附着胞形态和致病性（图8）。
综合上述结果，我们得出结论：复合鞘脂GlcCer参与了稻瘟菌的致病过程，ΔMolag1突变体的致病性丧失是由于该突变体中GlcCe产物的缺失所致（图9）。
图8 MoCGT1的生物学功能。a M.oryzae的菌落生长和分生孢子图。b ΔMocgt1突变体的附着胞类型及其所占比例。c 与Guy11相比，ΔMocgt1突变体的毒力减弱。dΔMocgt1突变体附着胞侵染宿主能力降低。e 在不同浓度的甘油下，附着胞（野生型和ΔMolag1菌株)细胞皱缩的百分比。
图9神经酰胺在M.oryzae附着胞中的作用模型。
讨论
本研究在附着胞发育的不同阶段，通过非靶向性代谢组学分析确定了6条显著变化的关键代谢途径。几个差异代谢物的变化趋势暗示了与能量和甾醇代谢相关的有趣的生物学见解。代谢组学数据表明，早期鞘磷脂对于M.oryzae附着胞的发育是必不可少的。研究人员利用小分子抑制剂和基因敲除的酶功能中断，以及遗传和化学回补实验，研究鞘脂生物合成在M.oryzae致病性中的作用。综上所述，鞘磷脂的生物合成途径对于M.oryzae附着胞的正常发育和致病性是必不可少的。研究进一步证明神经酰胺缺乏引起的附着体形态异常与细胞周期调控有关，神经酰胺作用于蛋白激酶C信号的上游，而蛋白激酶C信号是致病性所必需的，从而证明早期鞘磷脂在水稻稻瘟病的发病是必不可少的。
评论
本研究对整个病原发展过程进行非靶向代谢组分析，对感染水稻、小麦、大麦和谷子的真菌病原体中主要新陈代谢变化有了新见解。研究人员用两种不同的鞘脂生物合成酶小分子抑制剂成功地阻断了M.oryzae的致病性，证实了它们的实际应用。因此，本研究确定鞘脂生物合成途径是开发抗真菌药物的关键步骤和潜在靶点。未来利用这些重要代谢中间产物的研究将进一步加深我们对重要粮食作物中真菌稻瘟病发生的分子机制的基本理解。
原文网址：https://mbio.asm.org/content/10/4/e01467-19