科研 | Industrial Crops&Products: 多组学分析揭示象草紫色合成机制（国人作品）
编译：寒江雪，编辑：十九、江舜尧。
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在生物过程中所涉及的基因或代谢产物具有相同或相似的变化规律，因此利用转录组和代谢组关联分析是寻找关键代谢途径、关键基因和解释分子机制的有效途径。花青素是一种强抗氧化剂，对人和动物都有好处，但是富含花青素的牧草却很稀有。象草“Purple”富含花青素，其生物量高于大多数牧草。
为了对象草紫色的形成机制进行研究，分别对栽培品种“Purple”和“Mott”进行了转录组和代谢组学的分析，得到以下结论：
1) 两品种中的木犀草素、山奈酚、槲皮素、锦葵素、芹菜素、天竺葵素和花青素等代谢物含量有显著差异，其中锦葵素含量与紫色相关性强，说明可能在紫色形成中起主导作用。
2) 发现了16个黄酮生物合成途径的差异表达基因（DEG），这些基因可能参与紫红色形成和积累。
3) 鉴定出47个差异表达转录因子（TF），其中有15个和12个分别在P和G，L和G中均上调或下调。
4) 在11个DEG中发现55个SNP，在41个差异表达TF中发现231个SNP，说明SNP可能在调节基因表达中起重要作用。
本研究为象草叶色发育和花青素生产提供了重要信息，有助于培育花青素含量高的牧草品种。
论文ID
原名：Integrative analysis of metabolome and transcriptome reveals anthocyanins biosynthesis regulation in grass species Pennisetum purpureum
译名：通过代谢组和转录组综合分析揭示了象草花青素的生物合成调控
期刊：Industrial Crops & Products
IF：4.191
发表时间：2019.10
通讯作者：刘琳
通讯作者单位：四川农业大学动物科技学院
DOI号：10.1016/j.indcrop.2019.111470
实验设计
本研究选取栽培品种“Purple”和“Mott”作为实验材料。取“Purple”的紫色和浅紫色叶片，取“Mott”的绿色叶片，分别进行转录组和代谢组分析。代谢组分析紫色和绿色样本间在阴离子模式和阳离子模式下的差异代谢物。转录组分析组间差异表达基因及颜色相关的差异表达基因，转录因子及差异基因的SNP，挖掘颜色相关的候选基因并进行RT-PCR验证，最后综合代谢组合转录组结果联合分析。
结果
1 象草叶片的代谢差异
“Purple”品种上部叶为紫色，下部叶为浅紫色。“Mott”品种整个植株都是绿色。为了研究两个品种颜色不同的形成机制，从“Purple”取紫色（P），浅紫色（L）（图1a和b），从“Mott”取绿色（G）叶片（图1c）。对三片叶片进行代谢组分析，在阳离子（ESI+）和阴离子（ESI−）模式下分别检测到1094和1341种代谢物。对两种模式的数据分别进行PCA分析，三个样品分离明显（图2a和b）。在ESI+和ESI−模式中，共有162和275个物质表现出差异（图2c和d）。
2 P，L和G花青素衍生物积累的差异
叶色是植物品质的重要外观指标，由叶绿素、类胡萝卜素、类黄酮等多种色素决定。三组样品在黄酮、芹菜素、木犀草素、黄酮醇、山柰酚、槲皮素、天竺葵素、花青素、锦葵素和牡丹素的积累上存在差异。在ESI+和ESI-中，大部分代谢物的含量在P和L中都高于G（表1）。P与G相比，ESI+中2种芹菜素、1种木犀草素、3种天竺葵素和1种锦葵素含量较高，3种花青素含量较低。在ESI-中，2种芹菜素、4种天竺葵素、1种花青素、1种牡丹素和1种锦葵素在P中含量较高，1种山奈酚、1种槲皮素、1种天竺葵素和4种花青素在G中含量较低。
3 P，L和G叶片的差异表达基因
P和G样本调整P值（P<0.05）进行差异分析，筛选出4329个上调和4745个下调的DEG，其中4092（1980个上调和2112个下调）个基因有GO注释。L和G差异分析发现5548个上调和4480个下调的DEG，其中4324个（2583个上调和1741个下调）有GO注释。P和G组的差异基因GO富集分析到33个GO term，显著富集到DNA重组、DNA整合和ADP结合、转座酶活性功能。L和G组的差异基因显著富集到DNA代谢过程，蛋白质磷酸化，应激反应，碳水化合物衍生物结合，核糖核酸结合和嘌呤核苷酸结合等功能。
不同颜色叶片的转录本中有843个（P vs G）和700个（L vs G）DEG注释到118条KEGG途径上，其中有12条途径显著富集（P<0.05）。P和G组主要的富集途径有核糖体（131个DEG），同源重组（33个DEG），L和G组在植物-病原相互作用（74个DEG），同源重组（42个DEG）通路显著富集。这些途径揭示了象草不同叶色的代谢过程。
4 与颜色表达相关的基因
类黄酮生物合成、花青素生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成途径是与叶片色素沉着有关的三条主要生物合成途径，在象草中有176个基因参与了这些途径。在这些基因中，133个注释到类黄酮生物合成途径，其中16个DEG在与“紫色”和“绿色”品种比较时表达水平变化显著（表2）。注释到CHS，CYP73A，CCoAOMT，F3H，DFR，HCT，ANR，CYP98A，F3′H，和ANS的DEG具有相似的表达模式：这些基因在L组表达量最高，其次是P和G，说明这些基因可能参与了象草的紫色积累，可能形成白细胞色素并将其转化为花青素。此外，ANR在G中的高表达还可能诱导产生无色原花青素。
在类黄酮生物合成途径中，结构基因的表达不仅受DNA序列变异的调控，还受一些TF的调控，如MYB、bHLH和WD40。本研究共检测到145个MYB和105个bHLH TF，其中47个在P、L和G样本中有差异表达，包括24个MYB和23个bHLH。与G组相比，P组有15个DEG上调，L组有12个DEG下调。对16个黄酮生物合成相关的DEG和47个差异表达TF构建热图分析基因表达模式（图3），发现其中有一些具有相似的表达模式。通过筛选rho值（rho≥0.6）和p值（p＜0.5）计算相关系数发现一些基因和TF相关系数较高的关系对。
在“Purple”和“Mott”的11个DEG包括CYP73A, F3H, DFR, HCT, ANR, CCoAOMT和ANS发现55个SNP，其中包括21个同义突变SNP，22个非同义突变SNP，其余为未分类SNP。这些颜色相关基因和TF中的SNP可能相互作用，导致这16个基因在不同样本中的差异表达。
5紫色合成的综合分析
CHS的高表达有助于花青素和其他黄酮类化合物的产生，但CHS在G中的表达明显低于P和L（图4）。CYP73A，CCoAOMT，F3H 和DFR在G中的表达也较P和L低说明这些基因可能参与了象草中紫色和红色素的合成。ANS的表达在L和G之间存在差异，而在P和G之间不存在差异，说明ANS可能受下游代谢产物的调节，当色素产生足够多时ANS下调。尤其是下游基因ANR在三个样本中都高表达，在G中的表达水平是P和L的两倍。ANR在G中的高表达可能导致无色原花青素的产生。
花青素、天竺葵素、矮牵牛素、牡丹素、飞燕草素、锦葵素是植物中常见的六种花青素P在ESI+和ESI-中的锦葵素，天竺葵素和牡丹素水平高于L和G，而在花青素，飞燕草素和矮牵牛素中没有这种表达模式（表1）。锦葵素的差异表达模式符合预期模式（P>L>G），可能是紫色积累最重要的代谢产物。CHS、CYP73A、CCoAOMT、F3H、DFR和ANS是Purple品种中紫色相关的基因，说明这些基因的表达可能诱导紫色叶片相关代谢产物的积累。转录组分析结果与代谢组一致，表明紫叶色是由花色素苷生物合成相关基因表达模式的改变引起的。为了验证转录组数据的可靠性，对P和G样本进行了qRT-PCR分析， 6个基因的表达谱与转录组数据一致。
评论
本研究采用高通量测序技术，共鉴定出176个与颜色相关的基因，其中16个关键基因的表达水平发生了显著变化。其中DFR、CYP73A、CYP98A、ANS、F3′H和ANR被确认为紫色形成过程中重要的候选基因。此外，16个色素相关候选基因中的SNP和DEG中的49个TF可能共同调节这些基因的表达。与紫色有关的3种常见花青素，即锦葵素、天竺葵素和牡丹素，在P组中普遍高于L组和G组，表明它们是紫癜紫色的最重要来源。本研究在转录组和代谢组水平综合分析了象草紫色形成的分子机制，为鉴定调节植物色素合成相关基因奠定了基础。
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