科研 | 东北农业大学: 不同基因型甜瓜抗白粉病相关基因及途径的转录组比较分析(国人作品)
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论文ID
原名: Comparative transcriptome profiling of genes and pathways related to resistance against powdery mildew in two contrasting melon genotypes
译名: 不同基因型甜瓜抗白粉病相关基因及途径的转录组比较分析反应
期刊: Scientia Horticulturae
IF: 1.96（2020年升级到2区）
发表时间: 2018.07
通讯作者: Feishi Luan
通讯作者单位: 东北农业大学
DOI号: 10.1016/j.scienta.2017.09.033
结果
两种基因型叶片Px感染的差异
在田间种植后评估甜瓜PM的发生率（表1）。伊朗、托马克、维德兰塔斯、PMR-45和南塔斯都受到严重影响。在Edisto-47，MR-1，WMR29，PMR5，PMR6，PI 414723，PI 124111和PI 124112中未记录任何疾病。根据毒力评估（Mccreight，2006年），PM种族的特征是“ 2F”，并选择在可控环境下在Topmark和MR-1上进一步繁殖。接种2F小种，在Topmark叶片受白粉病菌侵染期间，尤其是168hpi时，产生了强烈的霉变，而在72和168hpi时，MR-1叶片上只检测到轻微的含氯化合物（图1），这反映了两种基因型对PM的反应存在显著差异。
DEGs的RNA测序、定位和鉴定
为了研究接种Px后甜瓜叶片基因表达的变化，采用RNA测序技术研究了MR-1和Topmark在0、24、72和168hpi时的基因表达谱。由HiSeq 2500系统生成的原始读取被严格的参数过滤。剔除不合格品后，从所有样品中获得了8.36亿个高碱基质量的净读。大约88.5%的这些干净的读数与甜瓜参考基因组对齐，其中88.2%个与独特的位置对齐，0.3%个对准多个位置（表2）。
在单个位点的阅读中，93.7%位于外显子，3.0%位于内含子，其中3.3%位于基因间区（图S1）。在每个样本的两个独立的生物复制品之间检测到FPKM值的高相关系数（R2）（R2=0.89–0.98，P<0.001），显示了我们的RNA序列数据的可接受再现性。通过对参考转录本的重排，在PM感染后的两个基因型中分别鉴定出16207和16284个表达基因（FPKM≥3）。为了评价MR-1与Topmark反应的差异，在不同时间接种Px。所有唯一映射到参考转录本的干净阅读都被描述为评估对照样品（0hpi）和其他处理样品（24-168hpi）之间基因表达的显著差异。使用两倍或更大变化和FDR<0.01的综合标准来确定DEGs。在MR-1样品中共鉴定出1888 deg，在顶部标记样品中鉴定出2842 deg，以供进一步分析。在接种后的每个时间间隔分析两个品种中的DEGs数量（图2）。
图2.在不同时间点，经过Px处理的Topmark和MR-1植物中差异表达基因（DEG）的分布。
RNA序列数据的qRT-PCR验证
为了验证我们转录组分析数据集的可靠性，通过与RNA序列分析中获得的标准化数据（见方法）的比较，使用qRT-PCR进一步分析从DEGs中选出的10个候选抗病基因。正如预期的那样，在所有时间点和处理条件下，两个品种的RNA-Seq和qRT-PCR结果之间都存在显著的正相关（图3A-K），表明我们的RNA-Seq结果是可靠的。
DEGs基因表达模式分析、聚类与功能分类
使用STEM软件，根据获得的基因表达模式，将在不同时间点在Topmark和MR-1中识别的DEG聚类为16个图谱。这两种基因型在Px感染后基因表达随时间变化的模式上有显著差异（图4A）。MR-1中，61.1%（1154）的DEGs在Px感染后表达水平发生明显变化，并显著聚集成4个高表达谱（2、13、14和15；P<0.05），且大部分DEGs聚集成13、14和15谱，并在Px感染后上调。此外，65.7%（1866）的DEGs被分为4个高表达谱（0,2,4和15；P<0.05），其中3个谱（0,2和4）在Px感染后呈下调趋势（图4A）。这些结果清楚地表明Topmark和MR-1对Px感染的转录反应存在显著差异。为了确定两种基因型中显着转录变化的功能重要性，对超表达谱中包含的基因进行了GO和KEGG分类分析（图4B–C，表S4）。在MR-1中，与生物刺激抗性应答有关的基因（GO：0009607，P <0.05），对外界刺激有应答的基因（GO：0009605，P <0.05），信号转导（GO：0007165，P <0.05）， 激酶活性（GO：0016301，P <0.05），转录因子活性（GO：0003700，P <0.05），植物-病原体相互作用（ko04626，P <0.05），植物激素信号转导（ko04075，P <0.05），苯丙氨酸代谢（ko00360，P <0.05），苯丙氨酸生物合成（ko00940，P <0.05）和谷胱甘肽代谢（ko00250，P <0.05） 在图谱13或图谱14中富集了这些基因，其中基因表达在24 hpi时增加，并且在随后的阶段保持了高表达水平，表明这些基因将在Px感染的每个阶段做出反应。碳代谢（ko01200，P<0.05）、光合生物体内的碳固定（ko00710，P<0.05）和果糖和甘露糖代谢（ko00051，P<0.05）在profifile 15 ，在早期上调，在72hpi后下调，说明MR-1叶片在后期开始恢复正常的光合作用状态。然而，在Topmark中，参与光合作用（GO:0015979）、二次代谢过程（GO:0019725）和细胞内稳态（GO:0019725）的基因在profifile 15中富集；这些基因在24 hpi时上调，在72 hpi后下调。与生物刺激（GO:0009607，P<0.01）、外部刺激（GO:0009605，P<0.01）、细胞壁（GO:0005618，P<0.01）和外部包封结构（GO:0030312，P<0.01）相关的基因在第2和第4个图谱中的表达量过高，其中24hpi时基因表达降低，随后维持在较低水平，提示Topmark对Px感染的转录组反应将被抑制。这些结果证明了基因和响应PM感染的功能途径存在明显的基因型差异。
高抗性基因型对Px感染的反应比易感基因型强，持续时间长
为了进一步评估MR-1和Topmark在不同时期对Px感染的反应，根据接种时间将两个品种的DEGs进一步分为两大类：短期Px接种（∼24hpi）和长期Px接种（24–168hpi）。与0hpi基因表达相比，短期接种Px后Topmark中仅发现721个上调和518个下调基因，MR-1中分别鉴定出416和145个下调基因。对可能导致Px感染的表达水平上调的基因进行富集分析表明，两种基因型之间存在显著差异。
分别在Topmark和MR-1中，共有721个和416个基因在第3级被注释为59个GO项。针对Px分生孢子的入侵，MR-1中的GO项有三类（生物过程[BP]、细胞成分[CC]和分子功能[M F]），特别是与生物胁迫耐受性有关的GO项。在生物过程的分类中，MR-1对应激反应（GO:0006950）、内源性刺激反应（GO:0009719）、细胞通讯（GO:0007154）和细胞死亡（GO:0008219）的特异性富集（P<0.005），提示这些基因可能在保护MR-1植物细胞免受Px进一步侵袭方面发挥重要作用。相反，Topmark在24hpi时只诱导了与一级和二级代谢相关的蛋白编码基因。这些结果表明，MR-1在转录水平上对Px胁迫的反应所发生的变化在初级阶段更为强烈，这与剖面13和14的表达模式一致（图4B）。在随后的处理阶段（长期接种Px），Topmark和MR-1中1373和948基因分别较0hpi上调，1334和713基因下调。与短期Px感染下观察到的高表达基因相似，长期Px感染下MR-1中与生物刺激反应（GO:0009607）、外部刺激（GO:0009605）、应激反应（GO:0006950）和细胞通讯（GO:0007154）有关的基因也上调，从基因表达分析推断（图S3B，表S5），在Px感染后，MR-1将在相当长的一段时间内保持强大的防御状态。在Topmark中，长期的Px感染对应激和刺激的转录反应并不明显，除了涉及单一生物代谢过程的基因（GO：0044710），光合作用（GO：0015979），转运蛋白活性（GO： 0005215）和催化活性（GO：0003824），这表明与Px感染不同阶段的Topmark相比，MR-1中早期疾病反应基因的激活更强，这是MR-1与Px反应不相容的原因。
讨论
快速的病原体识别可能导致MR-1对Px的高抗性
一些与植物-病原体相互作用相关的GO术语，例如对生物刺激的响应，对外部刺激的响应以及对胁迫的响应，表现出一种模式，其中基因表达水平在24 hpi时增加（图4C），表明植物与病原体相互作用的相关基因功能在Px感染后MR-1的抗病性中起着重要作用。更重要的是，根据路径富集分析，在MR-1中，植物-病原相互作用类别占上调基因的比例高于Topmark。植物抵御入侵病原体的第一道防线是由病原体相关分子模式（pamp）触发的天然免疫系统，模式识别受体（PRRs）识别pamp，从而产生pamp触发免疫（PTI）。大多数已知的prr需要富含亮氨酸重复序列（LRR）受体激酶BAK1发挥作用。BAK1是植物免疫的中心调节因子，因此是几种病原体毒性效应分子的靶点（Dodds和Rathjen，2010）。在本研究中，只有一个BAK1同源基因（MELO3C019027）在接种后的两个基因型中被鉴定为差异表达。在没有PM孢子侵染的情况下（0hpi），该基因在两个品种中的表达水平相似。在感染植株中，其表达水平在MR-1中显著上调，在72hpi时达到高峰，但在0-72hpi时没有显著差异，高峰延迟到168hpi，表明在Px感染早期，抗性基因型对Px感染的反应比敏感基因型快。这一结果与报告的结果相同。为了生存，大多数植物病原体已经进化出各种效应蛋白，它们进入宿主细胞来抑制PTI信号传导。植物相应地进化出抗性蛋白（R蛋白）来识别病原体效应器，最终导致植物防御的第二个层次，即效应器触发免疫（ETI）。R蛋白通常被描述为具有NBS、LRR和TIR结构域的蛋白质，其编码基因被称为R基因。在整个甜瓜基因组中，共鉴定出81个具有典型抗性结构域的R基因。在这些基因中，14个R基因在MR-1或Topmark中表现出不同的表达趋势（图5）；10个R基因在MR-1中在24 hpi时显著增加，并且显示出至少比0 hpi时高2倍的水平，这表明R基因在甜瓜和PM之间的相互作用中起着重要作用。其中两个R基因（MELO3C015353和MELO3C015354）在MR-1中的表达从24-72hpi显著上调，表达量比Topmark至少高5倍，而这些基因在Topmark中没有差异表达。如前所述，这些结果支持了这两个R基因是位于LG 2的PM抗性的关键候选基因的假设。为了限制病原体的生长，许多R蛋白需要高度保守的伴侣分子Hsp90。MR-1共鉴定出7个HSP同源基因DEGs。在这些基因中，有6个在24hpi时显著上调。与之相反，24hpi的Topmark没有上调，而Px的0hpi的Topmark没有上调，说明Hsp90可以积极调节甜瓜对PM的抗性。
PM易感基因型和PM抗性基因型的信号转导途径反应不同
除PTI和ETI外，系统防御反应（称为系统获得性抗性[SAR]）在抗病性中发挥重要作用，并受到负责信号转导的植物激素的调节，特别是JA、SA、ABA和ET。在本研究中，发现7个JA、2个SA、9个ABA和4个ET信号基因与MR-1对Px病原的不亲和反应有关。JA是一种重要的植物激素，对植物防御反应和发育过程至关重要。在本研究中，MR-1（而不是Topmark）中DEGs的最大数量富集于α-亚麻酸代谢（ko00592，P<0.001），这有助于JA的生物合成。在JA信号基因中，JAR1是激活JA所必需的JA氨基合成酶。在MR-1中，一个编码JAR1（MELO3C006046）的基因在24hpi时表达上调，达到0hpi时的3倍，而在Topmark中，在24hpi时表达下调，在72hpi时表达上调。在PM感染早期，5个编码茉莉酸ZIM结构域的基因（JAZ，MELO3C024336）和1个编码TF-MYC2的基因（MELO3C013851）表达增加。JAZs和MYC2参与了一个负调控反馈回路，为茉莉酸盐的脉冲反应提供了一个机制解释。在ABA信号转导中，MR-1在24hpi时有4个编码PYR/PYL的基因上调。PYR/PYL是信号复合物中的主要ABA受体。然而，这一途径，其中PYR/PYL被强烈抑制，而SnRK2被过度表达，在Topmark被抑制在两个治疗阶段，特别是在24hpi。因此，ABA诱导的抗氧化途径可能在Topmark对PM的抗性中发挥基因型特异性作用。在ET信号传导途径中，MR-1中有两个ET反应因子1同源基因（ERF1，MELO3C022985，MELO3C006430）在24小时时上调。与GCC盒相互作用的ERFs是由创伤、ET和病原体感染诱导的；这些ERFs通过GCC盒激活防御相关基因表达，促进植物获得抗病性。ERF在甜瓜中作为ACS2的转录激活因子，在JA/ET和SA信号转导途径之间的拮抗串扰中也可能发挥重要作用。一些ERF转录调控因子在过度表达时增强抗病性。TFs ERF1和ERF2的过度表达导致防御基因（PDF1.2和b-CHI）的转录水平上调，并增强对坏死性营养性病原体镰刀菌的抗性。
钙离子是植物细胞内普遍存在的第二信使。许多刺激可以改变细胞质中的Ca2+浓度。环核苷酸门控通道（CNGC）被认为是一个重要的Ca2+传导通道，并假设环核苷酸参与植物对生物和非生物胁迫的反应。在本研究中，编码CNGCs的三个DEGs（MELO3C022020）在24小时注射时MR-1显著增加，在PM感染的后期维持高表达水平；这些DEGs在Topmark中也显示出上调的趋势，但表达水平低于MR-1。葡萄中的一个CNGC同源基因在与霜霉病不相容反应的早期比后期更为活跃。这一结果提示CNGC介导了PM病原体的应答。钙依赖性蛋白激酶（CDPKs）对CNGCs介导的Ca2+信号的时空分布信息进行解码，引起代谢和基因表达的改变。两个CDPK同源基因（MELO3C012326，MELO3C007388）均在PM侵染后上调，表明CDPKs在甜瓜抗PM中起重要作用。感知环境变化（温度、盐胁迫和病原体）后最早的事件之一是细胞内游离钙浓度的变化。这一信息被认为通过钙结合蛋白（CML）解码来驱动特定反应。MR-1在PM感染早期上调8个CML同源物，在PM感染后期下调。这些CML同源基因在Topmark中的表达高峰延迟到PM感染后期。呼吸爆发氧化酶同系物（rboh基因）与AOS的产生有关，并负责触发植物的防御反应。两个rboh同源物（MELO3C005718，MELO3C005719）在24hpi时比MR-1中的0hpi显著增加，但在Topmark中没有。病毒诱导的基因沉默（VIGS）实验表明，烟草对疫霉的抗性需要两种rboh同源物（NbrbohA和NbrbohB）。
Px接种后抗性基因型中更多的转录因子对病原菌的攻击反应
通过在特定时间和特定过程中调节基因转录，TFs及其调控网络在多种生物和非生物胁迫反应中发挥重要作用。为了确定能够调节MR-1和Topmark品种间对Px差异反应的TFs，在PlantTFcat数据库中搜索MR-1和Topmark中识别的所有deg。在DEGs中，MR-1和Topmark中分别发现了204和221个属于33和35个TF家族的假定TFs（表S6）。这两个品种的四个剖面中，大多数TFs都得到了富集（表3和表4）。
在植物-病原相互作用过程中，对病原微生物挑战负责的已知和假定TFs（例如MYB、WRKY、NAC、bZIP和ERF家族的成员）被激活（Moffat等人，2012；Pandey和somsich，2009）。这些TF家族在MR-1中比Topmark中富集了更多的DEGs，并且大多数TFs在Px接种后持续上调并保持高表达水平（轮廓13-15），包括MR-1中的14个WRKY、7个NAC和8个MYB TFs，而只有3个NAC TFs在Topmark中显示类似的表达模式。值得注意的是，只有两个WRKY同源物在topmmark感染晚期表达上调，表明WRKY是抗PM所必需的。
在PM抗性基因型中，防御相关产物对Px感染的反应更强
通过巩固植物细胞壁和积累各种植物抗毒素，许多次生代谢物被认为在植物对病原体入侵的防御反应中发挥重要作用。胁迫诱导的具有抗菌活性的低分子量次生代谢物统称为植物抗毒素，是植物防御反应的重要组成部分。这些蛋白质是在应激和病原体入侵后重新合成的。先前的研究表明，黄瓜植株在PM感染后对诱导治疗产生高水平的植物抗毒素。在葫芦中，各种苯丙酸、类黄酮、酚类化合物和二苯乙烯可作为植物抗毒素发挥作用，并已被证明在真菌抗病性中发挥积极作用。
在本研究中，MR-1中鉴定出的大多数病原菌诱导的DEGs都富含与植物抗毒素生物合成有关的途径，如类黄酮生物合成（ko00941，P<0.001)；二苯乙烯类、二芳基庚烷类和姜辣素生物合成（ko00945，P<0.001)和苯丙酸生物合成（ko00940，P<0.001). 参与苯丙酸生物合成的14个基因在MR-1中表达显著上调。其中6个基因编码苯丙氨酸解氨酶（PAL:EC：4.3.1.24)，有助于反式肉桂酸的生物合成。这些基因在早期表现出低表达水平，然后在PM的长期感染下显著上调，表明MR-1中的PM胁迫导致苯丙酸的合成增强和细胞壁在不相容相互作用中的强化，而不是在与Topmark的相容相互作用中。在7个编码过氧化物酶（POD:EC:1.11.1.7）的基因中，有5个在24小时感染诱导高表达，在MR-1中保持高表达，但在Topmark中被抑制，表明在宿主不亲和反应的早期，有多种木质素的产生和细胞壁的强化。发现7个与不相容相互作用相关的deg参与了黄酮类、苯乙烯类、二芳基庚烷类和姜辣素的生物合成途径（ko00941和ko00945），包括一个编码查尔酮合酶的基因（CHS:EC:2.3.1.74条)，两个编码莽草酸邻羟基肉桂酰转移酶（HCT），一个编码查尔酮异构酶（CHI:EC：5.5.1.6节)，一个编码香豆蔻酰奎宁（香豆蔻酰莽草酸酯）3′单加氧酶（CYP98A），一个编码咖啡酰CoA O-甲基转移酶（CCOAMT）和一个编码反式肉桂酸4-单加氧酶（C4H）。两个品种PM侵染后，这些基因均显著上调，但没有差异，说明这些具有相似机制的次生代谢产物参与了甜瓜（抗性或敏感基因型）对PM的植物防御反应。
在本研究中，脂肪酸合成（FAS）、PS和碳水化合物水解（CH）相关基因在不相容相互作用的早期被激活，但在感染的后期被抑制。这一发现与之前关于接种烟草疫霉后烟叶和葡萄霜霉病中的PS下降的报告非常一致。
霉菌基因座O（MLO）在抗病性中的调控作用
霉菌基因位点O（MLO）基因家族编码与后生动物G蛋白偶联受体（GPCR）在结构上相关的植物特异性蛋白，该蛋白具有多个跨膜结构域和钙调蛋白结合结构域，并且可能参与了对钙依赖性刺激。 多项研究表明，MLO基因家族的特定成员在葫芦科植物中充当PM易感性因子。实际上，由于基因敲除或敲除而使其失活与特定形式的抗性有关，称为MLO抗性。在先前的研究中鉴定出16个CmMLO基。当在本研究中使用的两个品种中评估这些基因在抗PM中的作用时，5个CmMLO基因被鉴定为在72hpi时在Topmark中显著上调，显示出与0hpi相比至少两倍的表达变化，而PM感染后MR-1基因表达无明显差异。结果表明，这些上调的MLO基因促进了Topmark对PM的易感性。
与PR蛋白相关的DEGs参与了不同基因型间PM抗病能力的差异
为了确定MR-1和Topmark之间PM反应的不同性质所导致的关键DEGs，在24、72和168hpi下对两种不同基因型进行了成对比较。共鉴定出2053个非冗余deg。此外，在0hpi时，两种基因型之间的比较获得2633 DEGs，其中954 DEGs是PM感染后检测到的DEG集的特异性（图6）。
这些DEGs被认为是假定的“PM反应基因”，与这两种基因型PM反应的不同性质有关。PR蛋白是参与植物抵御病原入侵的一组蛋白的关键组成部分。β-1,3-葡聚糖酶（BG:EC 3.2.1.39），俗称PR蛋白，在植物抵御真菌病原体方面发挥着重要作用。β-1,3-葡聚糖酶的抗病作用可催化β-1,3-葡聚糖的水解裂解，β-1,3-葡聚糖是真菌细胞壁中的主要结构成分，并抑制病原体的生长。鉴定了三个β-1,3-葡聚糖酶同源基因（MELO3C023847、MELO3C014182、MELO3C004704）在两个基因型间差异表达。尤其是，在MR-1中，MELO3C023847和MELO3C004704的表达水平显著上调，在24hpi时明显高于Topmark。先前的研究表明，β1,3-葡聚糖酶的酶活性在健康植物中通常较低，但在真菌感染期间会增加。编码β-1，3葡聚糖酶的基因在葡萄感染挑剔木质部后上调。我们的发现清楚地表明β-1，3-葡聚糖酶参与了MR-1，在PM的防御反应中起着重要作用。此外，我们还鉴定了3个编码PR蛋白1（PR1:K13449；MELO3C018540，MELO3C018539，MELO3C018538）的DEGs，它们在顶标中下调，但在PM感染后MR-1没有变化，表明PR1对甜瓜抗PM并不重要。在拟南芥中，防御相关基因PR1和PR2是由寡糖诱导的，寡糖是野油菜黄单胞菌细胞表面的主要成分，可以防止过敏反应。胼胝质在发育过程中由许多地方的植物合成，并对生物和非生物胁迫作出反应。MR-1中发现3个胼胝质合成酶（E2.4.1.34）同源基因（MELO3C016698、MELO3C023243、MELO3C023512）下调，而其中只有一个基因（MELO3C023509）上调。在MR-1中观察到吸器颈周围胼胝质的积聚，其对PM具有I型或II型抗性，并在Px增殖停止前增加。在携带抗性基因PM-1（PMR-45）、PM-2（PMR-6）、PM-3（PI 124111F）、PM-4（PI 124112）、PM-5（pi124112）和PM-6（pi124111f）的甜瓜品种中，对PM有类似的结构反应。这些结果表明，MR-1中胼胝质的沉积加强了感染部位的细胞壁，防止了真菌的侵入。几丁质酶（CHIT:EC 3.2.1.14）能催化真菌细胞壁主要结构成分几丁质的水解。植物中几丁质酶的存在对于抵御病原体很重要。本研究鉴定了6个几丁质酶同源基因在两个品种间的差异表达。其中4个基因（MELO3C010249、MELO3C002759、mel03c00588、MEO3C005859）在MR-1中表达上调，表现出高于Px感染后Topmark的表达水平，特别是在72hpi时，其表达比Topmark高3倍。这些结果表明几丁质酶在甜瓜抗性基因型中起重要作用。
评论
本研究对MR-1抗性基因型和Topmark敏感基因型的基因表达变化进行了比较转录组分析。结果表明，几个关键的候选调控因子在甜瓜抗PM中起着高度优先的作用。根据上述比较分析和结果确定的潜在候选调节因子和抗PM的分子机制在图7中总结。在这个简单的甜瓜-过氧化物酶相互作用网络中，MR-1中的PRR和R蛋白能快速感知和检测Px释放的相应pamp和致病效应物，并诱导防御信号转导，包括JA、SA、ABA、ET、Ca2+和ROS途径，而PTI和ETI则在Px感染后在Topmark中被延迟或抑制。在防御信号转导启动后，对已鉴定的deg中TFs的分析表明，TF家族具有已知的重要防御作用，如MYB、WRKY、NAC和ERF家族；这些TFs被激活，随后调节与代谢产物相关的下游疾病防御的产生，包括PR蛋白、酚类化合物、苯丙酸、类黄酮和苯乙烯类化合物。此外，一些初级代谢和MLO基因也可能通过非典型机制在防御反应中发挥重要作用。MR-1感染部位最终出现局部过敏性坏死，限制了PM的进一步发展。因此，DEGs的转录谱分析和鉴定为甜瓜抗PM机制的研究提供了有价值的信息。
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