科研 | 河南师范大学:转录组学和转基因分析揭示了SA反应途径参与了怀菊花对坏死性真菌的防御机制（国人佳作）
编译：Young，编辑：夏甘草、江舜尧。
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论文ID
原名：The integration of transcriptomic and transgenic analyses reveals the involvement of the SA response pathway in the defense of chrysanthemum against the necrotrophic fungus Alternaria sp.
译名：转录组学和转基因分析揭示了SA反应途径参与了怀菊花对坏死性真菌的防御机制
期刊： Horticulture Research
IF：5.404
发表时间：2020.6
通讯作者：赵喜亭
通讯作者单位：河南师范大学
DOI号：1038/s41438-020-0297-1
实验设计
结果
观察并记录了“怀菊2＃”的表型变化，以研究链格孢菌的影响。“怀菊2＃”生长受到感染。尽管该新品种比其亲本植物对这种真菌具有更好的耐受性，但接种10天后，叶片出现了典型的病斑，接种15天后叶片继续长大，形成明显的坏死症状。相反，在用模拟SDW对照处理的对照叶片上未观察到这种病原性反应（图1a）。为了确定“怀菊2＃”叶片中的SA或JA途径是否对链格孢菌有反应，进行了ELISA。所得数据表明，与接种后的前5天相比，接种叶片中SA和JA的含量显着增加（图1b）。另外，进行酶促测定以检查PAL，POD，PPO，APX，GLU和CHT是否对链霉菌有反应。感染。结果表明，所有这些酶的活性在被链格孢菌感染的叶片中明显更高。与用SDW处理的对照叶片相比（图1c）。这些数据表明，“怀菊2＃”中的防御系统对感染链格孢菌有响应。
图1 用无菌蒸馏水（SDW，模拟）或链格孢菌接种“怀菊2＃”后，表型（a）激素含量（b）和防御酶活性（c）的变化。右上角插入的黄色框是从植物底部选择的叶子的放大图像，并以黄色框突出显示。数据是三个生物学重复的手段。误差线表示SE。直方图上方的字母表示使用单向方差分析确定的不同线条之间的统计学差异（P <0.05）。比例尺：1 cm
2 基因表达的RNA-Seq分析
要了解与链格孢菌相关的DEG的功能。感染时，使用GOseq注释Cm_0 d的序列，Cm_3 dpi的6206 DEG和Cm_5 dpi的5455 DEG。该注释产生了三个主要类别：生物过程，细胞成分和分子功能。对生物学过程类别的分析表明，Cm_3 dpi与Cm_0 d的1870个上调的单基因与“细胞代谢过程”相关，Cm_5 dpi与Cm_0 d的1818个上调的基因与“有机物质代谢过程”相关。在细胞成分的类别中，“泛素连接酶复合物”子类在Cm_3 dpi对Cm_0 d和Cm_5 dpi对Cm_0 d方面是最丰富的。在分子功能的类别中，显示上调的DEG富集的类别的最大数量与“结合”有关，并且最重要的亚类是Cm_3 dpi对Cm_0 d和Cm_5 dpi对Cm_0 d的“蛋白激酶活性”。
图2 Cm_3 dpi与Cm_0 d（a）和Cm_5 dpi与Cm_0 d（b）中基于上调的DEG进行GO分析
为了更好地了解链格孢菌激活的代谢或信号转导途径。感染后，序列用KEGG注释。与Cm_0 d相比，Cm_3 dpi分配了571个DEG到13个路径，而Cm_5 dpi分配了430个DEG到10个路径。在这些DEG中，涉及“植物-病原体相互作用”的基因最丰富，其次是涉及“植物激素信号传导”，“苯丙烷生物合成”和“类黄酮生物合成”的基因。
图3 DEG富含不同的KEGG途径
为了确定DEG是否与不同的时间点的关系，使用基因表达聚类来鉴定具有相似表达模式的基因。通过该分析，我们获得了10个DEG簇，其中DEG在subcluster_3中的表达相对较高且稳定，而其他簇中的DEG则是动态表达的（图4a）。为了了解在某个时间点上特异性表达的基因，分析了DEG来创建维恩图，该图显示了5952个上调基因和2435个下调基因。特别地，在Cm_3 dpi与Cm_0 d中特异性表达了8128个基因，包括4417个上调基因和3746个下调基因。在Cm_5 dpi和Cm_0 d中总共表达了5137个基因，包括4417个上调基因和3746个下调基因（图4b）。
图4 连续上调DEG的分析 a DEG的聚类分析；b连续上调DEG的维恩图。灰线表示基因在不同样本中的相对表达，蓝线表示基因在不同样本中的所有相对表达。圆圈的重叠部分表示两个组合之间的共用的DEGs
热图是为了更好地理解与“怀菊2＃”对链格孢菌的抗性相关的关键DEG。产生的热图显示参与植物-病原体相互作用的DEG持续上调。根据它们的功能注释，这些基因包括18个PAMP触发免疫（PTI）基因，一个R基因（图5a），6个活性氧（ROS）代谢途径基因（图5b），55个Ca2 +信号通路基因（图5c），8个丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路单基因（图5d）。获得了18个参与SA反应途径的DEG，包括9个PR，5个转录因子TGA基因和4个NPR1单基因（图5e）。另外，热图中显示了37个防御酶基因，包括15个POD，1个PAL，1个1 GLU，5个CHT，2个PPO，1个APX和2个SOD单基因（图5f）。
图5“怀菊2＃”中对感染链格孢菌的反应不断上调的基因热图。条形图代表不同处理中每个基因（FPKM）的表达水平的大小，如红色/绿色矩形所示。红色的基因显示上调，绿色的基因显示下调。a PTI和R基因，b ROS代谢途径，c Ca2 +信号传导途径，d MAPK信号传导途径，e SA信号传导途径，f防御酶
为了验证从RNASeq分析获得的DEG的可靠性，使用qPCR分析了12个候选基因的表达水平。这些基因包括4个防御酶基因（CmPAL，CmPOD，CmGLU和CmCHT），2个SA反应信号途径基因（CmNPR1和CmPR1），2个Ca2+信号通路基因（CmCPK和CmCNGF），一个ROS代谢途径基因（CmRboh），一个PTI基因（CmCf-9）和2个JA信号途径基因（CmMYC2和CmJAZ）。对于这些DEG，计算了RNA-Seq和qPCR结果之间的相关系数（r）。结果表明qPCR数据与RNA-Seq数据密切相关，表明RNA-Seq数据可靠。此外，qPCR数据显示，“怀菊2＃”接种链孢菌种后，参与JA信号通路的CmMYC2和CmJAZ以及与SA信号通路相关的CmNPR1和CmPR1被上调。（图6）
图6“怀菊2＃”中鉴定的12个DEG的表达水平与对感染链格孢菌的反应。通过RNA-Seq和qPCR分析确定了12个DEG的表达谱之间的相关性。左y轴显示通过RNA-Seq确定的FPKM值，右y轴显示通过qPCR确定的相对表达水平。CmUBI用作参考基因。RNA-Seq和qPCR结果之间的r值在每个代表基因表达的图的左角列出。a CmPOD，b CmPAL，c CmGLU，d CmCHT，e CmNPR1，f CmPR1，g CmWYC2，h Cmcf-9，i CmCNGF，j CmRboh，k CmCPK，l CmJAZ
为了确定SA应答途径的基因表达增加是否与'怀菊2＃'对链霉菌的耐受性相关，我们克隆了CmNPR1，这是一种上调的DEG，编码与SA信号通路相关的转录辅因子，并且使用了35 S启动子在“怀菊2号”中过表达。根据对潮霉素B（HmB）的抗性选择并通过半定量PCR和qPCR进行验证，“怀菊2＃”的遗传转化产生了11个阳性转基因品系。另外，基于转基因的表达水平，三个转化体35 S :: CmNPR1＃17（较低的过表达），35 S :: CmNPR1＃10（中等过表达）和35 S :: CmNPR1＃4（较高的过表达）以评估它们对链格孢菌的抗性。使用上述方法感染。结果表明，三株系对交链孢菌具有较强的抗性。感染并显示出黑斑形成减少。特别地，35 S :: CmNPR1＃4品系表现出最弱的症状（图7a），表明CmNPR1的表达越高，耐药性越好。此外，我们进行了qPCR来表征转基因植物中SA反应途径中涉及的三个基因和与植物防御相关的三个基因的表达谱。结果表明，在3 dpi和5 dpi时，三种S反应途径基因CmTGA1，CmTGA5和CmPR5的表达水平在35 S :: CmNPR1＃4中显着高于野生型对照。在这两个时间点，35 S :: CmNPR1＃4中三个防御基因CmPAL，CmPOD和CmCHT的表达水平也显着高于WT。进一步的酶促测定表明，与野生型对照植物相比，三种酶的活性在35 S :: CmNPR1＃4中显着增加（图7c）。在35 S :: CmNPR1＃17行（过低表达）和35 S :: CmNPR1＃10行（中间过表达）中获得了类似的结果（补充图S7）。这些发现表明“怀菊2＃”中CmNPR1的过表达增加了与黑斑病抗性相关的SA反应途径的活性。
该模型包括与“怀菊2＃”基因组中存在的JA信号，SA反应，JA生物合成，SA生物合成，PTI和防御相关途径有关的基因以及其他基因。当植物被坏死性链格孢菌这些病原体中，增加了对黑斑耐受性的这些基因的表达被激活。“怀菊2＃”中CmNPR1的过表达增加了植物对感染链格孢菌的抗性。
总之，通过RNA-Seq产生了超过58.6 GB的clean reads。与Cm_0 d相比，在Cm_3 dpi和Cm_5 dpi的比较中分别获得了16,550和13,559个DEG。对DEGs的功能注释和聚类分析表明，在对怀念链球菌的“怀菊2＃”响应中，激活了由R蛋白，ROS信号，Ca2 +信号，MAPK信号和SA信号介导的多种防御反应。CmNPR1的过表达增加了植物对链格孢菌的抗性。我们的结果表明，SA应答途径和其他信号途径参与了“怀菊2＃”对坏死性真菌链格孢菌的应答。
图8“怀菊2＃”对链格孢菌的耐受机制的假想模型。虚线表示待研究的未知物，绿色实线表示通过RNA-Seq找到的信息，红色实线表示通过实验验证的信息
评论
总之，通过RNA-Seq产生了超过58.6 GB的 clean reads。与Cm_0 d相比，在Cm_3 dpi和Cm_5 dpi的比较中分别获得了16,550和13,559个DEG。对DEGs的功能注释和聚类分析表明，在对怀念链球菌的“怀菊2＃”响应中，激活了由R蛋白，ROS信号，Ca2 +信号，MAPK信号和SA信号介导的多种防御反应。CmNPR1的过表达增加了植物对链格孢菌的抗性。结果表明，SA应答途径和其他信号途径参与了“怀菊2＃”对坏死性真菌链格孢菌的应答。
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