科研 | 在土壤生物电化学修复中，细菌、真菌和古生菌之间相互作用的转移促进了抗生素和抗生素耐药基因的去除
本文由艾奥里亚编译，十九、江舜尧编辑。
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抗生素和抗生素抗性基因（ARGs）是土壤中的两种污染物，尤其是ARGs是危害人类健康的三大威胁之一。本研究探究了以抗生素作为燃料的土壤微生物燃料电池（MFCs）的性能。在本研究中，添加四环素的土壤MFCs表现出最佳的生物发电性能，分别比添加磺胺嘧啶和对照的MFCs高出25%和733%。与非电极处理相比，开路和闭路处理不仅使功能微生物发生了变化，而且微生物总数分别增加了50%和340%，以适应较高的抗生素去除率。在开路处理中，微生物间无效的相互作用有所降低，而对抗生素的去除效率提高了7%~27%。对于闭路处理，建立了一个具有生物发电、降解和氮转化能力的强化代谢网络，使抗生素的去除率提高了10-35%。重要的是，导入电极后，ARGs和可遗传因子（MGE）的丰度降低，特别是在闭路处理中，最高分别降低了47%和53%。基于本研究，土壤MFCs在消除抗生素和抗生素抗性基因（ARGs）方面具有优势，比对照高出7~8倍的发电量。与磺胺类药物相比，四环素类在土壤中去除的增强效果更好，会降低潜在ARGs传播风险。本研究首次同步揭示了土壤生物电化学系统中细菌、真菌和古生菌的相互关系及其与ARGs和MGE基因的关系。
论文ID
原名：Shifting interactions among bacteria, fungi and archaea enhance removal of antibiotics and antibiotic resistance genes in the soil bioelectrochemical remediation
译名：在土壤生物电化学修复中，细菌、真菌和古生菌之间相互作用的转移促进了抗生素和抗生素耐药基因的去除
期刊：Biotechnology for Biofuels
IF：5.452
发表时间：2019
通讯作者：李晓晶；李永涛
通讯作者单位：农业部环境保护科研监测所；华南农业大学
实验设计
用碳纤维布阳极和活性炭空气阴极组装了单室土壤燃料电池（6cm×6cm×9cm）（图8）。使用前先用丙酮隔夜清洗6cm×6cm尺寸的碳纤维布，再用本课题组之前的方法制备活性炭空气阴极（6cm×6cm）。闭路土壤MFCs的外部电阻为100ω。用丙酮预处理的碳纤维（长度1cm）作为质量分数的1%混入被测土壤中，以降低土壤内阻并提高生物发电。此外，非电极控制没有阳极，没有阴极，没有碳燃料。所有土壤MFCs均用300 g被测土壤（加入120毫升去离子水）搅拌。
实验分为三组。第一组为封闭土壤MFCs（标记为TC），开路MFC（TO）和非电极对照MFC（TN）加四环素（5mg kg−1）。第二组为封闭土壤MFCs（SC）、开路MFC（SO）和非电极对照MFC（SN）加磺胺嘧啶（5mg kg−1）。对照组不加抗生素（分别标记为CC、CO和CN）。所有处理都是在30℃恒温下培养。
图8 非电极组（A）、开路组（B）和闭路组（C）的土壤MFCs结构。
实验结果
1 土壤MFCs的生物发电
土壤MFCs的启动时间定义为输出电压大于1mv所需的时间（100Ω的外部电阻）。TC（含四环素的闭路处理）启动时间为9h（图1a），比SC（含磺胺嘧啶的闭路处理，16h）和CC（不加抗生素的闭路处理，17h）早7~8h。在1~3d内，TC的第一个电流密度峰值出现在65 ± 6 mA m−2，比SC（53 ±1 mA m−2）和CC（22 ± 1 mA m−2）分别高23%和196%。在第27天，TC和SC的最大电流密度分别达到136 ± 3和109 ± 6 mA m−2，而CC的电流密度在第19天达到最大值，仅为47 ± 1 mA m−2。TC和SC的累积电荷输出分别为1132 ± 48和940 ± 82 C，分别比CC（142 ± 26 C）高出7~8倍（图1b）。基于对土壤MFC达到最大电流密度时的功率密度和极化曲线分析可以发现（图1c-d），其大小顺序为：TC（31 ± 1 mW m−2）> SC（25 ± 7 mW m−2）> CC（1.8 ± 0.03 mW m−2）。此外，TC、SC和CC的开路电压（OCVs）分别为0.37 ± 0.02、0.36 ± 0.03和0.18 ± 0.01 V。从各自的极化曲线来看，SC和TC的内阻分别为336 Ω和262 Ω，比CC（1332 Ω）低75-80%。
图1 培养58天的电流密度（a）和电荷输出（b），以及土壤MFCs的功率密度曲线（c）和极化曲线（d）。添加四环素、磺胺类和不添加抗生素的闭路处理分别标记为TC、SC和CC。
2 四环素和磺胺类抗生素的去除
体外培养58天后，与相应的非电极对照组相比，四环素和磺胺嘧啶的去除率分别从46 ± 2.7%和86 ± 0.2%提高到72 ± 3.1%和95 ± 0.7%（图2a-b）。正如期待的那样，TC表现出最高的平均降解率（70 ± 3%），其次是四环素的开路处理（TO，66 ± 2.5%）和四环素的非电极处理（TN，52 ± 6.1%）（图2c）。同时，磺胺嘧啶的降解率与四环素相同：SC（95 ± 0.5%）> SO（磺胺嘧啶开路处理，93±1.2%）> SN（磺胺嘧啶非电极处理，87±1%）。意外的是，电极的引入（开路）促进了抗生素的降解，其降解率比相应的非电极对照提高了7-27%（p<0.05）。封闭电路C层的浓度比相应的开路层低15-42%（图2a-b）。TC残留浓度在A层最低（1.4 ± 0.2 mg kg−1），在C层略有增加（1.5±0.1 mg kg−1），但都比S层低14-16%（图2a）。对于SC而言，C层的磺胺嘧啶残留量最低（0.23±0.04 mg kg−1），比其它层低9-17%（图2b）。
图2 四环素（a）和磺胺嘧啶（b）在不同土层中的浓度（直方图）和降解率（线状图），以及抗生素的平均浓度和降解率（c）。不同的小写字母分别表示TC、TO和TN或者在SC、SO和SN在0.05水平上具有显著性差异。四环素的闭路处理、开路处理和非电极处理分别被标记为TC、TO和TN；而添加磺胺嘧啶的则分别被标记为SC、SO和SN。
3 靶基因的发展
本研究共检测到37个靶基因，包括28个抗生素抗性基因和9个可遗传因子基因。在供试土壤中检测到18个tet基因，其中tetG和tetPA的检出率为100%（n=27）。在所有的sul基因中仅检测到sul2基因，检出率为100%（n=27）。在所有被检测的MGE基因中，优势基因为intI1、Tn24和Tn25，检出率为100%（n=27）。靶基因的相对丰度归一化为16S rRNA基因（基因拷贝数/16S rRNA拷贝数）。除了TC中的MGEs基因外，电极（开放电路）的引入降低了ARGs和MGEs基因的丰度，而在生物电流刺激（闭路）下，ARGs和MGEs基因的丰度进一步下降（图3）。例如，与SN相比，这些基因在SO中下降了约39%，在SC中又下降了14-22%。同时，C层和A层的ARGs和MGEs基因丰度均低于相应的S层，尤其是TC，下降了18-54%。ARGs的最小丰度出现在TC的A层和SC的C层，与TC和SC中残留的抗生素浓度一致。
图3 四环素（a）和磺胺类（b）中tet和sul基因的相对丰度以及四环素（c）和磺胺类（d）处理MGEs基因的相对丰度。TC/TO/TN/SC/SO/SNC、TC/TO/TN/SC/SO/SNA和TC/TO/TN/SC/SO/SNS分别代表同一反应器中的层C、层A和层S。
4 微生物群落
对土壤样品进行16S rRNA扩增测序，细菌、真菌和古细菌群落分别为73327-95166，52654-95683和75515-94890个有效序列，平均长度分别为253，221和280bp；此外，基于97%的相似度共获得1757-5392、400-859和127-1006个可操作分类单元（OTUs）。同时，Good's涵盖的估计量均在98%以上，表明测序深度对微生物群落是适宜的。
基于Shannon和Chao1指数表明，细菌群落对磺胺嘧啶的敏感性高于四环素。与CC相比，SC指数下降了9-25%。同时，与SN相比，SC层S指数下降了28-50%。Proteobacteria，Firmicutes和Bacteroides为主要优势细菌，他们的相对分数占全部细菌总量的52-84%（图4a）。与相应的非抗生素处理相比，添加抗生素使Proteobacteria的OTUs增加了18%，而Bacteroides减少了19-69%（图4d-f）。与SN相比，SO中Proteobacteria的丰度增加了5%，SC中进一步增加了16%。在添加四环素的处理中，电极的引入使Firmicutes和Bacteroides的丰度略有降低（3%~6%），而在生物电流刺激下，Firmicutes和Bacteroides的丰度明显增加28%~81%。在所有处理中，S层的Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria的丰度都较高，而A层和C层的Deltaproteobacteria丰度分别比S层分别高47-212%和56-388%。Firmicutes的种类（主要是Clostridia和Bacillus，89-96%）聚集在A层，如SC，与其他层相比，A层有227-364%的生长。除了SC和SO外，Bacteroides主要分布在A层。
图4 基于门水平上，MFCs中细菌（a）、真菌（b）和古菌（c）的土壤群落微生物DNA序列的分类；基于科水平上对Proteobacteria（d）、Firmicutes（e）、Bacteroides（f）的微生物DNA序列分类。CC代表不加抗生素的闭路处理；CO和CN分别代表相应的开路和非电极处理。
前55个属的分布占细菌总数的20-54%（图5a）。相对丰度最高的细菌属为Pseudomonas（3%，Proteobacteria），与相应的非抗生素处理相比，添加四环素和磺胺嘧啶后，Pseudomonas的丰度分别增加了13%~155%和160%~691%。添加抗生素后，Methylobacter，Desulfocapsa和Geoalkalibacter的含量分别增加了92~666%、29~299%和42~376%。添加四环素后，Tumebacillus，Geobacter，Acinetobacter和Pseudoxanthomonas分别增加了46-281%、91-229%、13-736%和37-175%，而添加磺胺嘧啶后，Anaerolinea和Methylobacillus的丰度分别增加了13-224%和120-557%。与相应的非电极处理相比，加入电极后，添加四环素使Pseudoxanthomonas和Geobacter的丰度分别增加了45%和103%。与相应的开路处理相比，生物电流刺激后，Anaerolinea，Desulfocapsa和Tumebacillus的数量分别增加了42%~60%、58%~69%和24%~106%。与土壤MFCs相关联，A层的Bacillus的数量比同一反应器的其他层高16-452%（图5s）。Desulfocapsa的种类也显示出类似的结果，其在SC中增加了13-14倍。在添加四环素的处理中，C层和A层中的Geobacter和Geoalkalibacter的数量分别比闭路组和开路组的S层增加了63-285%和132-645%。
图5 在属水平上，在土壤不同分层中土壤细菌（a）、真菌（b）、古菌（c）的DNA序列分类
与相应的非抗生素处理相比，添加抗生素使Shannon（TN除外）和Chao1（SC除外）指数增加，尤其是TC（增加了18-24%）。与相应的非电极处理相比，添加磺胺嘧啶和非抗生素处理的Shannon指数分别下降了10%和4%。在生物电流刺激下，Shannon指数进一步下降6-11%。在添加四环素的处理中，Shannon指数有相反的趋势。在门的水平上，Ascomycota的丰度占所有文库总组成的82-93%，其次是Ascomycota（8-15%）、Basidiomycota（1-4%）和Chytridiomycota（0.5-2.6%）（图4b）。与相应的非抗生素处理相比，除TN外，添加抗生素后Ascomycota的OTUs都有所降低。Zygomycota和Chytridiomycota则分别增加了8-68%（SN除外）和51-463%（TN除外）。与相应的非电极处理相比，在CO（不添加抗生素的开路处理）下，Ascomycota的OTUs增加了816~1858 OTUs，SO在生物电流刺激下又增加了596~3840 OTUs。A层的Zygomycota种类比其他层丰富。在添加磺胺嘧啶的处理中，随着电极的引入，A层中Zygomycota的丰度比非电极处理降低了16%，而在生物电流刺激下，Zygomycota的丰度增加了29%。
对相对丰度占前35的真菌属绘制热图进行聚类分析（图5b）。前两个属分别为Fusarium（11%）和Trichoderma（5%）。添加四环素和磺胺嘧啶后，Trichoderma的丰度分别提高了64-670%和49-191%。与相应的非电极处理相比，引入电极后，磺胺嘧啶处理使得Trichoderma的数量增加了149%，生物电流刺激使Trichoderma的数量进一步增加了82%。添加抗生素（SC除外）后，Kernia的含量增加了19-102%。与土壤MFCs相联系，与相应的非抗生素处理相比，添加抗生素后，Wardomyces和Gymnoasus的丰度分别增加了14-234%和114-506%。与相应的非电极处理相比，在加抗生素的开路和闭路处理中，Wardomyces的丰度都增加了23-148%。此外，添加抗生素可刺激Microascus的数量增加，闭路组增加最多（93%~122%），其次是开路组（32%~97%）和非电极组（12%~50%）。与相应的非电极处理相比，电极的引入使Microascus的数量增加了44-90%，在生物电流刺激下进一步增加了17-71%。
与相应的非抗生素处理相比，添加四环素处理的Chao1指数提高了48-84%。与相应的非电极处理相比，随着电极的引入，Chao1指数增加了12-31%，在生物电流刺激下，添加抗生素的处理中，Chao1指数进一步增加了4-21%。添加四环素后，在分层的土壤中，Chao1指数的作用比Shannon指数的作用更明显，尤其是在TC的A层，Chao1指数上升了183%。Taumarchaeota和Euryarchaeota是土壤MFCs中的主要古菌，占测得所有真菌文库总成分的88-96%（图4C）。与相应的非抗生素处理相比，Taumarchaeota和Euryarchaeota对磺胺嘧啶的添加更为敏感。其中Taumarchaeota的数量减少了22-31%，而Euryarchaeota的数量却增加了140-189%。与相应的非电极处理相比，在添加四环素的处理中，随着电极的引入，A层中的Euryarchaeota的数量减少了18%，在生物电流刺激下进一步减少了47%。在添加磺胺嘧啶的处理中可观察到相反的趋势。
前15个古菌属占总组成的31-91%（图5c）。Candidatus Nitrososphaera（16%，Taumarchaeota）、Methanosarcina（12%，Euryarchaeota）和未鉴定的Nitrososphaeraceae（11%，Taumarchaeota）是土壤中古菌的优势属。与相应的非抗生素处理相比，添加四环素后Candidatus Nitrososphaera的数量增加，最高值为28%，而添加磺胺嘧啶后则下降了15-25%。Methanosarcina有相反的趋势（TN除外）。SO中Methanosarcina的丰度比SN增加了16%，SC的丰度进一步增加了10%。值得注意的是，Methanosarcina在SC的A层是主要优势古菌，其丰度比TC高420%（图5c），同时，TC的A层比TN的丰度下降了72%。
5 网络代谢分析
通过对ARGs、MGEs基因和微生物的网络分析，揭示了ARGs的潜在宿主和可能的传播途径（图6）。在本研究中，tetPA基因的寄主范围最广，其中65%为真菌。TnpA和TN23基因与tetPA基因有较强的相关关系。然而，TnpA、TN23基因与tetPA基因的潜在宿主之间缺乏紧密的联系。Sul2和tetG与Pseudomonas，Methylophilus，Methylobacillus（细菌）、Trichoderma（真菌）、Methanosarcina，Methanolobus以及Methanomethylovorans（古菌）有共同的寄主。同时，sul2、tetG、clntl1、Tn21、Tn24和Tn25之间存在着紧密的联系，说明clntl1、Tn21、Tn24和Tn25在Sul2和tetG的增殖过程中起着重要的作用。此外，上述4个MGEs基因也与可能的宿主Sul2和tetG表现出强烈的同源性。Clntl1基因属于整合子基因，它能将ARGs等外源基因整合为自己的表达单位，并将其传递到转座子或质粒上。Tn21、Tn24和Tn25基因属于转座酶基因，通常携带非转座子基因（如ARGs）进行转座，从而导致ARGs的传播。以前的研究表明，四环素和磺胺抗性基因被编码在相同的MGEs基因上，以实现扩散。因此，sul2和tetG基因可能在Pseudomonas，Methylophilus，Methylobacillus，Trichoderma，Methanosarcina，Methanolobus和Methanomethylovorans的增殖过程中编码clntl1、Tn21、Tn24或Tn25基因。这表明，土壤MFC系统不仅可以抑制或延缓ARGs的发生，而且其潜在的传播风险也是可以控制的。
图6 网络分析显示了AGRs、MGE基因和微生物在属水平上的相关性关系。每条边表示两个项目之间的正相关关系。
与非电极和开路处理相比，在闭路处理中，微生物相关链接增加了14-50%，其中正相关占总链接的80%（图7a-c）。相比之下，在开路和非电极处理中，正相关链接仅分别占总连接的57%和59%。为了探讨功能性微生物之间的种间关系，去除了微生物之间的负联系，然后将丰度低于相应的非抗生素对照的微生物排除在外，进一步降低了微生物的数量（图7d-f）。虽然不同处理的新网络的节点数相似，但闭路组的微生物密度（边）分别比开路组和非电极组高193%和340%。根据网络拓扑参数，闭路组中的新网络表现出最佳性能，其次是开路组。例如，与非电极组相比，开路组中的最短路径增加了121%，在闭合回路组中进一步增加290%。在以上分析的基础上，虽然开路组的微生物总数比非电极组弱（图7b-c），但功能微生物在非电极组中高于非电极组。这表明，在开路处理中，抗生素的生物降解过程中一些不相关的相互关系降低，从而提高了生物降解的效率。电极的引入和生物电流的刺激不仅增强了功能微生物的亲和力，而且改变了微生物群落结构。通过MCODE在闭路组中发现了两个子模块，其中第一个子模块的网络得分较高，达到7分。在Bacillus，Nitrosospira，Desulfocapsa，Geoalkalibacter，Tiobacillus，Microascus以及Wardomyces中观察到极其密切的联系。
图7 基于细菌、真菌和古菌在属水平上对闭路组（a）、开路组（b）和非电极组（c）添加抗生素的网络代谢图分析以及在加入抗生素处理中，去除与相比丰度较低的微生物之后的闭路组（d）、开路组（e）和非电极组（f）的网络代谢图分析。红边代表显著的正关系，蓝边代表显著的负关系（P<0.05）。每个节点的大小与相应微生物的丰度成正比。
总结
土壤MFCs在消除抗生素和ARGs方面具有优势，同时比对照高出7~8倍的发电量。与磺胺类化合物相比，四环素在土壤中的强化去除率更高，而潜在的ARGs传播风险更低。在开路和闭路处理中，功能微生物的群落结构和种间关系得到了重建和加强，以适应生物降解的处置功能。在引入电极后，抗生素生物降解的一些无效的物种间关系被削弱。在闭路处理中建立了一个集发电、降解和氮转化为一体的集约化微生物群落网络。揭示这些生物相互作用是提高生物电化学修复系统多功能的关键。
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