PCR检测技术概述

我心目中检测技术史上的几次革命性发明分别是基于抗原抗体特异性结合原理的免疫标记技术，PCR技术和测序技术。今天我们来聊聊PCR技术，按照PCR技术的演进，人们习惯性的将PCR技术划分为三代：普通PCR技术，实时荧光定量PCR技术和数字PCR技术。

一、普通PCR技术

KARY MULLIS （1944.12.28-2019.8.7）

Kary Mullis于1983年发明了聚合酶链式反应法（polymerase chain reaction ，PCR），据说是载着女友开车的时候，忽然灵光一闪，想到了PCR原理（论开车的好处）。Kary Mullis于1993 年获诺贝尔化学奖。《纽约时报》如此评价：' 具有高度原创性和重大意义，几乎将生物学分为 PCR 前和 PCR 后两个时代。

PCR的原理：在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。

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普通PCR的优点

  1. 经典方法，国际和国内标准齐全

  2. 仪器试剂成本较低
  3. PCR产物可以回收后做其他分子生物学实验

普通PCR的缺点

  1. 容易污染

  2. 操作繁琐
  3. 只能定性分析
  4. 敏感性中等
  5. 存在非特异性扩增，当非特异条带与目的条带大小一样时无法区分
基于毛细管电泳的PCR
针对普通PCR的缺点，一些厂家推出了基于毛细管电泳原理的仪器，将PCR扩增后电泳的步骤在毛细管中完成，灵敏度更高，可以区分几个碱基的差异并且通过MAERKER可以计算出扩增产物的含量。缺陷是仍然需要将PCR产物打开后放入仪器，仍然存在很大的污染风险。

毛细管电泳图

二、实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR ，qPCR）技术

荧光定量PCR也叫Real-Time PCR，是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术。荧光定量PCR的发展史是一部ABI、罗氏和伯乐等巨头的荡气回肠的斗争史，感兴趣的可以去查查。该技术是目前最成熟，使用最广泛的半定量PCR技术。

荧光染料法（SYBR Green I）：

SYBR Green I是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，与双链DNA非特异性结合。在游离状态下，SYBR Green 发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合，其荧光增加1000倍。所以，一个反应发出的全部荧光信号与出现的双链DNA量呈比列，且会随扩增产物的增加而增加。由于染料是与双链DNA的非特异性结合，因此可能产生假阳性的结果。

荧光探针法（Taqman 技术）：

PCR扩增时，加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。该探针为一直线型的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，检测不到荧光信号；PCR扩增时（在延伸阶段），Taq 酶的 5' － 3' 切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。临床检测中Taqman探针法是最常用的检测方法。

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qPCR的优点

  1. 方法成熟，配套仪器试剂齐全

  2. 试剂成本中等
  3. 操作简单
  4. 检测敏感性高，特异性高

qPCR的缺点

1.目的基因发生突变导致漏检

2.低浓度模板检测结果无法确定
3.使用标准曲线进行定量检测时误差较大。
三、数字PCR（digital PCR ，dPCR）技术
数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR能够直接读出DNA/RNA分子的个数，是对起始样品核酸分子的绝对定量。1999年，Bert Vogelstein和Kenneth W.Kin-zler正式提出了dPCR的概念。
2006年，Fluidigm公司第一个生产商业化的基于芯片的dPCR仪。2009年，Life Technologies推出了OpenArray和QuantStudio 12K Flex dPCR系统，2013年，Life Technologies又 推 出 了QuantStudio 3DdPCR系统，采用高密度的纳升级微流控芯片技术，将样本均匀的分配至20 000个单独的反应孔中。
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2011年，Bio-Rad公 司 推 出 了 基 于 微 滴 的QX100 dPCR仪，利用油包水技术，将样品平均分配到20 000个微滴油包水中，利用微滴分析仪对微滴进行分析。2012年RainDance公司推出了RainDrop dPCR仪，在高压气体驱动下，将每个标准反应体系分割成包含100万至1 000万个皮升级别微滴的反应乳液。
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至此数字PCR就形成了2大派别，芯片式和微滴式。不论是哪种数字PCR，其核心原理都是有限稀释，终点PCR和泊松分布。将含有核酸模板的标准PCR反应体系，平均分配成几万个PCR反应，分配到芯片或微滴中，使每个反应中尽可能含有一个模板分子，进行单分子模板PCR反应，通过读取荧光信号的有或无进行计数，经过统计学泊松分布的校准进行绝对定量。
下面列举一下我使用过的几种数字PCR平台的特点：

1.Bio-Rad QX200 微滴式数字PCR

伯乐QX200是一个很经典的数字PCR平台，基本的检测流程：通过微滴生成仪生成20000个油包水微滴，在普通PCR仪上扩增，最后通过微滴读取仪读取每一个微滴的荧光信号。操作较为复杂，污染风险中。

2.新羿 TD1 微滴式数字PCR

新羿 TD1是一个国产的数字PCR平台，基本的检测流程：通过微滴生成仪生成30000-50000个油包水微滴，在普通PCR仪上扩增，最后通过微滴读取仪读取每一个微滴的荧光信号。该平台的微滴生成和读取都在专用的芯片中进行，污染的风险低。

3. STILLA Naica 微滴芯片式数字PCR

STILLA Naica是一个较新的数字PCR平台，基本的检测流程是：将反应液加入芯片，将芯片放入微滴生成扩增系统，生成30,000个微滴单层平铺于芯片中，PCR扩增在芯片上完成。然后将扩增后的芯片转移至微滴阅读分析系统，采取拍照的方式读取荧光信号。由于整个过程在封闭的芯片中进行，污染的风险较低。

4.ThermoFisher QuantStudio 3D 芯片式数字PCR

ThermoFisher QuantStudio 3D是另一个经典的芯片式数字PCR平台，其基本的检测流程是：将反应液加入到涂布器中，通过涂布器将反应液均匀涂布在有20000个微孔的芯片上，将芯片放在PCR仪上扩增，最后将芯片放入读取仪中采取拍照的方式读取荧光信号。操作较为复杂，整个过程在封闭的芯片中进行，污染的风险较低。

5.JN MEDSYS Clarity芯片式数字PCR
JN MEDSYS Clarity是一个较新的芯片式数字PCR平台，其基本的检测流程是：将反应液加入到涂布器中，通过涂布器将反应液均匀涂布在固定在PCR管中有10000个微孔的芯片上，反应液通过毛细管作用进入芯片，将带有芯片的PCR管放在PCR仪上扩增，最后将芯片放入读取仪中采取拍照的方式读取荧光信号。操作较为复杂。污染的风险较低。
汇总各数字PCR平台的参数如下：

数字PCR平台的评价指标有：分割单元数，荧光通道数，操作复杂性和污染风险。但是最重要的是检测准确性，评估数字PCR平台的一种方法是使用多个数字PCR平台互相验证，另一种方法是使用定值准确的标准物质。

dPCR的优点

  1. 实现绝对定量

  2. 更高的敏感性和特异性
  3. 可以检测低拷贝样品

dPCR的缺点

1.仪器设备和试剂昂贵

2.操作复杂，检测时间长
3.检测范围较窄

目前三代的PCR技术各有各的优缺点，也各有各的应用领域，并不是一代取代一代的关系。技术的不断进步给PCR技术注入了新的活力，使其能解锁一个又一个的应用方向，使核酸检测更方便、更准确。

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