fibroblast中表达的Lef1维持成年小鼠皮肤伤口再生的发育潜能

文章题目：Lef1 expression in fibroblasts maintains developmental potential in adult skin to regenerate wounds
期刊：Elife
发表日期：2020年9月
DOI：https://doi.org/10.7554/eLife.60066.sa1

摘要

本文使用scRNA技术测序四种皮肤中的细胞：再生性、疤痕性、稳态中、发育中的皮肤。鉴定出新生鼠的papillary fibroblast【浅层真皮成纤维细胞】形成一种瞬态再生性细胞类型，这种细胞类型可以促进年轻的皮肤再生。这些成纤维细胞是由经典Wnt转录因子Lef1的表达定义的，并使用功能gain-and-loss基因小鼠，证明了成纤维细胞中Lef1的表达引发了成年皮肤的宏观环境，从而增强了皮肤的修复能力，包括使用毛发的毛囊再生。伤口愈合后的立毛肌。最后，我们在一个可搜索的交互式伴侣网站（https://skinregeneration.org/）中共享基因组数据。这些数据和资源一起提供了一个平台，可以利用新生皮肤的再生能力来开发可促进成人组织再生的临床上易处理的解决方案。

方法

单细胞测序的皮肤：

  • P2, P21,  P2和P21 2mm伤口7天后的边缘，
  • 每个样本用3只小鼠，产生3个独立的library，所以是总共12个库。

结果

1.生物学现象和单细胞测序结果聚类

  • a,b分别是P2和P21的正常皮肤染色，c,d 是2mm 伤口后7天的切片染色图。发现P2的皮肤中有再生的毛囊。
  • 测序，P2, P21,  P2和P21 2mm伤口7天后的边缘,每个样本用3只小鼠，产生3个独立的library，所以是总共12个库，筛选后共66407个细胞。使用的是Louvain modulating analysis，鉴定出18个clusters，并对这些cluster注释。图e是四组的命名。

为了鉴定出对再生有突出的贡献的细胞类型，做了各种细胞类型的统计，如下图。在regenerating组中并没有出现独有的细胞群。在regenerating和scarring组，以下细胞都有相似表现：keratinocyte，lymphocyte，melanocyte等。伤口中的fibroblast对于毛囊诱导有重要作用，接下来研究cluster3, cluster4, cluster16.

将 cluster3，4，16提取出来，做整合，再聚类。如下，10个cluster, 注释，并统计各个cluster在4组实验中所占比例：

目标是鉴定出一种细胞群：可以支持毛囊再生，且不是由伤口诱导。锁定cluster0

2.Lef1驱动developing fibroblast中新生papillary谱系细胞的分化轨迹

使用Pdgfra和Twist2 marker分离出developing skin中的细胞，与已知的分群重叠。如下图a-e，结论是 先前确定的成纤维细胞异质性和谱系可以在developing skin中的scRNA-seq分析中鉴定出来，附加有papillary fibroblast的亚群

为预测developing fibro的未来状态并找到驱动基因，做了RNA velocity 分析，见上图f。结果显示，DP是分化终点，而papillary fibro会转变为Dpp4 亚群。但是reticular的分化轨迹指向立毛肌且也会转变为Dpp4 亚群，这与之前的体内谱系追踪实验结果不一致，但是与体外chamber 毛囊重组实验结果一致。

研究了下驱动分化轨迹的driver 基因，下图i，并作了PANTHER 信号通路聚类，图h。两个图显示出Lef1可能是驱动RNA velocity向papillary fibro和DP转化的基因。wnt信号通路中的Lef1和Wnt5a都很重要。

做了个切片染色，看Lef1 的表达，如下图。Lef1代表新生鼠papillary fibro的一个亚群。

3.新生鼠皮肤的再生需要Lef1的表达-Lef1基因敲除小鼠

确定Lef1是否对再生很重要，使用Twist- Lef1cKO转基因小鼠。图a-e，Lef1确实敲除，不在papillary fibroblast中表达，且不影响DP中Lef1的表达。图f- k，野生型小鼠，伤口后可以再生毛囊，且DP中表达Lef1（图g,i），敲除后，伤口中再生不能再生毛囊

4.真皮Lef1的表达使得成年皮肤大伤口中的再生能力增强-Lef1过表达小鼠

使用Lef1真皮过表达小鼠，Twist-Lef1KI。图a-e，转基因小鼠中过表达Lef1。使用这种小鼠做大伤口实验。【前人报道，成年小鼠的大伤口中心，也能再生毛囊。】图f-k表明，1.2cm2大伤口实验条件下，Twist-Lef1KI愈合创口的毛囊数量是 Lef1KI组的毛囊数量5倍，且Twist-Lef1KI再生的毛囊有立毛肌。

5.真皮中Lef1使得scarring wound 转变为regenerative

使用Twist-Lef1KI小鼠看小伤口的情况。【伤口小于等于8mm的，形成疤痕】，做了如下实验：

结果是：

  • 形成疤痕：野生型、Twist-Lef1K1两组小鼠的 P24。图b-c,l
  • 带有立毛肌的毛囊再生：Twist-Lef1K1小鼠P40,P90. 图d-k,l

结论：Lef1在真皮中的表达诱导皮肤支持伤口中的毛囊再生，其变化取决于时间点和毛囊周期。

为什么 Twist-Lef1K1小鼠的 P24伤口后形成疤痕？比对8mm直径的圆形伤口和1.2cm2的正方形伤口，伤口愈合上皮化时间点，毛囊再生的激活因子和抑制因子。如下图：

结果发现，8mm直径的伤口，7dpw有很多Lef1抑制子；1.2cm2的上皮化过程中有很多激活子高表达。

讨论

被广泛承认的是，胎儿和新生的皮肤可以无疤痕愈合，但是成年组织不可以。本文主要是鉴定了一种瞬态存在的papillary fibro，主要表达Lef1。成年真皮中诱导Lef1的表达可以支持其毛囊再生。

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