创伤性脑损伤后肠屏障破坏和内毒素血症:对创伤后癫痫的影响
引言：
创伤性脑损伤(TBI)可能导致肠屏障(IB)破坏，并导致肠道共生细菌的产物，包括脂多糖(LPS)逸出进入血液。来自UCLA的Andrey Mazarati团队，使用侧向液压冲击损伤(LFPI)动物模型，研究了创伤后癫痫(PTE)是否与肠道通透性及内毒素血症增加相关，结果发表在2021年4月的Epilepsia杂志上。
文献地址：https://doi.org/10.1111/epi.16909
研究背景
创伤性脑损伤(TBI)是癫痫的一个确定病因:据估计，创伤后癫痫(PTE)的发病率在4%至53%之间，远远超过了癫痫的0.5%-0.8%的总体发病率。创伤性脑损伤的影响不仅限于大脑，越来越多的证据表明，TBI后肠道的组织完整性和功能受损。自主神经功能异常是TBI的一个典型病理生理特征。“脑损伤通过破坏脑桥迷走神经系统的激活，导致肠道自主神经功能减少和炎症反应的产生。这些事件损害了紧密连接的正常功能，导致肠通透性增加，从而允许肠道和血液之间非正常的分子运输，而这些分子可能是肠道共生菌群的产物。
具体来说，脂多糖(LPS，又称内毒素)是革兰氏阴性菌外膜的一种成分，当肠道屏障被破坏时，它在循环中被检测到。重物撞击导致的大鼠脑外伤模型中，伴随着肠屏障通透性的增加，在急性损伤期间，血流中同时出现LPS(即内毒素血症)。内毒素血症可能与癫痫有关，尽管脂多糖-癫痫的联系似乎是复杂的。一方面，LPS通过激活toll样受体4，并与病原体相关分子模式和损伤相关分子模式相互作用，具有强烈的促癫痫作用。这些影响甚至在外周给予LPS(类似内毒素血症)后也会发生，而且持续时间可能超过LPS暴露本身。
另一方面，有一种称为LPS调节的现象被描述，即LPS抑制炎症相关的小胶质细胞活化，从而提供神经保护，并在TBI后发挥抗癫痫作用。综上所述，创伤性脑损伤引发的一系列表面上的事件，包括肠神经系统失调、随后的肠屏障破坏和内毒素血症，可能在PTE中起作用。
本研究利用建立的大鼠TBI-PTE连续-中重度侧向流体冲击损伤(LFPI)模型，检验了所描述的事件是否确实与PTE相关。
研究方法
利用SD大鼠，采用侧向流体冲击模型（LFPI），在造模前、造模后1周和7个月后，通过肠内给药测定异硫氰酸荧光标记右旋糖酐(FD4)的血浆浓度，检测肠道通透性。
ELISA测定相同动物的血浆LPS浓度。
LFPI术后7个月采用视频脑电图(electroencephalography)监测PTE发作情况。
具体设计如下：
156只大鼠行侧向流体冲击损伤造模(LFPI)， 95只大鼠(65%)存活。红色矩形:LFPI 1周后，共17只大鼠采血，进行荧光素异硫氰酸盐标记的葡聚糖(FD4)和脂多糖(LPS)检测。其中，有10只大鼠不能进入慢性研究:4只大鼠在LFPI后2个月内死亡，2只大鼠在LFPI后6个月内因健康原因安乐死，4只大鼠在LFPI后7个月内不能采血。红色和绿色矩形重叠:这组中的七只大鼠进入了慢性研究阶段。绿色矩形:随着7只大鼠从1周开始，在LFPI后1周增加8只未使用FD4和LPS分析的大鼠于LFPI后7个月使用。因此，慢性研究共涉及15只大鼠(绿色矩形)，其中7只用于重复采血(红绿重叠)。LFPI术后7个月，采血进行FD4和LPS测定，然后植入电极，4周进行视频脑电图(EEG)监测。另外，从50只大鼠中随机抽取8只sham大鼠，并于术后1周使用，其中7只动物达到7个月的时间点。
研究结果
1.LFPI后一周
这些实验在17只LFPI和8只假手术组大鼠（sham）中进行。
LFPI严重程度的参数如表1(第一行)所示。
在LFPI前采集的血浆样品中，FD4和LPS均未检出；两种分析物在手术前和术后1周均未在sham大鼠的血浆中检测到。LFPI后1周，14只大鼠血浆中检测到FD4，两种分析物的水平之间有很强的正相关性（图3A）。
两种分析物中任何一种的血浆水平与LFPI严重程度的参数如呼吸暂停的持续时间、脚趾挤压的恢复和翻正反射之间没有统计相关性（表1）。同时，FD4和LPS水平与整体神经评分之间存在显著的负相关（表1；图3B，C），反映了神经损伤的程度与血浆FD4和LPS水平正相关的事实。
7只大鼠分别于LFPI 1周前和LFPI 7个月后3个时间点重复测定血浆FD4和LPS水平。
对于FD4, LFPI后两个时间点之间没有统计学意义的相关性(图4B)。
与此同时，在LPS测量中，1周和7个月的时间点之间存在显著的负相关
2.血浆FD4和LPS水平与自发癫痫的比较
在4周的视频和脑电图监测期间，15只大鼠中有5只检测到2次或以上(最大7次)的自发癫痫发作。
行为学上，癫痫发作介于racine 3级(前肢阵发性发作)和5级(站立和跌倒)之间。
当比较沿发作线划分的LFPI大鼠亚组之间的FD4和LPS血浆水平时，发现PTE大鼠血浆中各分析物的水平明显高于无PTE大鼠(图5A,B)。
其他分析显示，自发癫痫发作与两种分析物的血浆水平之间存在强正相关(LPS vs癫痫发作，Spearman r = 0.82, p =0 .001;FD4与癫痫发作，Spearman r = 0.68, p = 0.01)。Sham组未检出癫痫发作。
在继续随访的7只大鼠组中，由于分层取样的样本量小(3只有PTE, 4只没有PTE，图5C,D)，沿发作线的分析物血浆浓度的统计比较不确定。
创伤后1周，3只发生PTE的大鼠血浆LPS水平(值:未检出、未检出、8.3 pg/mL;图5D，红色)明显低于未发生PTE的4只大鼠。
相反，LFPI 7个月后，3只复发性癫痫发作的大鼠血浆脂多糖水平(值:7.7、27.9和39.5 pg/ml)高于4只无癫痫发作的大鼠(值:3只未检测到，1只4.6 pg/ml；p =0 .057)。
讨论
1.研究结果总结
小肠屏障的破坏发生在早期和远期损伤期间，并且在两个时间点与内毒素血症相关。早期肠屏障破坏和内毒素血症与损伤后神经功能缺陷的严重程度相关，而远期事件与PTE相关。Sham组术后两个时间点血浆中均无FD4和LPS，排除了术后感染和衰老是肠功能障碍和内毒素血症的原因。
2.肠道屏障破坏与内毒素血症
内毒素血症在两个时间点是肠道屏障破坏的直接后果。
研究结果支持了这一观点，即不同病因的肠道屏障通透性增加后，外周血中出现细菌产物。
还应注意的是，在两个时间点，血浆LPS检测的动物比FD4少。这进一步支持了内毒素血症继发于肠道通透性增加的假设，并且有一个内毒素血症的肠道通透性阈值。
3.早期脑外伤后检测物波动的意义
LFPI术后不久，肠屏障破坏和内毒素血症很可能是创伤的直接结果，而且从综合神经评分来看，反映了急性创伤后运动功能障碍的严重程度。创伤性脑损伤后肠道损伤的确切机制仍不完全清楚，但正如引言中所提到的，似乎包括创伤性脑损伤诱发的自主神经功能障碍。肠道菌群的不平衡也可能是一个促成因素。在我们最近未发表的研究中，LFPI后1周，我们发现肠道muciniphila Akkermansia丢失，这是一种对维持肠道屏障的完整性很重要的细菌。最有趣的是，与损伤早期LPS水平较低的动物相比，那些在创伤后不久血浆LPS水平较高的大鼠出现慢性癫痫的可能性更小。虽然进一步的研究肯定是有根据的，但这些发现提出了一种可能性，即损伤后早期内毒素血症可能在创伤性脑损伤后具有长期的保护性“调节”作用，正如LPS所描述的那样，而不是在许多其他研究中所显示的持久的促癫痫作用。
4.远期脑外伤后检测物波动的意义
TBI后远期血液中FD4/LPS水平与PTE的存在高度相关，这表明这些事件之间存在联系。可能很难区分因果关系，但基于所有讨论过的数据和常识，我们的假设是，肠道功能障碍和内毒素血症是复发性癫痫的结果，而不是创伤性脑损伤本身。不同病因的发作会破坏血脑屏障，癫痫发作是否也会导致肠屏障通透性增加和周围炎症，可以在癫痫发作模型(如癫痫持续状态，或点燃)中检测。与此同时，LPS诱导的外周炎症的促癫痫作用已经得到证实。此外，LPS可促进血脑屏障的破坏， (这种破坏)具有诱发癫痫的作用。
5.早期与远期检测物波动的比较
根据对7只大鼠的观察，似乎小肠通透性和内毒素血症的远期波动并没有反映LFPI后不久首次检测到的持续性损伤。事实上，在内毒素血症的情况下，发生了完全相反的动态，在早期和远期血浆LPS水平之间存在显著的负相关。根据所有讨论和获得的结果显示，急性损伤后内毒素血症很可能具有调节作用(例如，通过抑制小胶质细胞和神经保护作用)，从而转化为对PTE的保护。相反，远期内毒素血症，很像早期的内毒素血症，可能具有潜在的抗癫痫作用。
6.外伤后内毒素血症的机制
细菌产物如脂多糖可以通过包围肠细胞的细胞旁空间穿过肠屏障。细胞旁通路的通透性受紧密连接、粘附连接和桥粒的调节，正常情况下允许水和离子通过，但排斥较大的分子，如脂多糖。通过改变上皮细胞紧密连接蛋白(如claudins)的表达或细胞骨架重排，这些细胞间连接被破坏，可导致细菌产物通过肠屏障易位；随后，细菌产物如内毒素通过肠淋巴管吸收，经胸导管进入循环。紧密连接蛋白表达的改变和内毒素血症已在脑损伤后不久被报道。在急性和慢性应激模型的背景下，先前已报道过来自大脑的信号影响肠道通透性的
过度活跃的下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴作用于肠上皮受体，增加肠通透性肠上皮也受交感神经纤维支配，并表达β2-肾上腺素能受体，β2-肾上腺素能受体一旦激活，可改变细胞旁通透性。由于TBI诱导的自主神经功能异常而激活的这些通路可以将TBI与肠道通透性的增加联系起来。
研究结论
实验性创伤性脑损伤导致肠道屏障即刻和长期的破坏，并导致血液中出现明显的细菌内毒素。
早期的内毒素血症反映了急性创伤后运动障碍的严重程度，但可能具有长期的保护作用;
远期的内毒素血症可能是由PTE触发的，具有诱发癫痫的作用。
译者：伏鹏飞，四川广元人，华山医院神经外科博士，师从胡锦教授，主要从事中枢神经系统损伤修复及神经重症的临床和科研工作。