Cas9表达腺病毒载体是什么？

CRISPR/Cas9（规律成簇的间隔短回文重复序列及相关蛋白9）核酸酶表达载体属于几种新兴的基因组编辑工具之一（另外两种是ZFN和TALEN），可在基因组的靶位点快速有效地产生突变。这些质粒载体编码的特异性RNA，能够引导DNA核酸酶（或缺刻酶）编辑基因组中特定位点的DNA序列。

Cas9是RNA引导DNA核酸酶，是天然原核免疫系统的一部分，赋予细菌产生对质粒和噬菌体等外源遗传物质的抵抗能力。在细胞内，Cas9核酸酶与引导RNA（gRNA）形成复合物，该复合物通过与基因组中的18-22nt的同源靶序列直接相互作用，gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上，然后切割基因组中的靶位点。

使用CRISPR打靶目的基因需要目标细胞同时表达Cas9和特异gRNA。这可以通过在同一个载体上共表达Cas9和gRNA，也可以通过在两个载体各上自表达Cas9和gRNA来实现。使用Cas9和gRNA两个载体分开表达的优势在于可使用不同的gRNA与不同的Cas9变体组合（如野生型Cas9，Cas9n，dCas9），从而根据实验目的带来更多变的实验方案。

Cas9表达腺病毒载体系统可以有效地在多数哺乳动物细胞中表达Cas9蛋白，但是其载体为游离形式存在于细胞中，不整合宿主基因组。腺病毒常用于体内基因转导，以及基因治疗和疫苗研究领域。

Cas9表达腺病毒载体首先以质粒的方式构建并使用E. coli扩增，然后转染进入包装细胞。在包装过程中，位于两个反向重复序列（ITR）之间的DNA片段与由包装细胞表达的病毒蛋白进一步包装成病毒颗粒。当病毒转导宿主细胞时，载体并以游离DNA的形式存在于细胞核中。两个ITR区域之间的Cas9基因和其他病毒基因组分由此进入了细胞。

通过改造优化，我们的腺病毒载体缺失了E1A、E1B和E3区，前两者与病毒包装相关（这两个基因已被整合到包装细胞的基因组中）。因此，运用我们的病毒载体包装出来的病毒是复制缺陷型的（只能转导靶细胞而不能自我复制），大大提高了生物安全性。