科研 | 转录组学和代谢组学分析揭示苹果属观赏海棠如何抵抗臭氧
编译：Mr. Left，编辑：夏甘草、江舜尧。
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臭氧（O3）是一种氧化性有毒空气污染物，在工业化国家和发展中国家普遍存在。为了了解O3暴露对苹果的影响并探索其防御机制，作者将“Hongjiu”海棠暴露于O3并通过生理，转录组学和代谢组学分析监测了其响应。暴露于300 nL L-1 O3下3 h对海棠的叶片造成明显损伤，影响了叶绿素和花青素的含量，并激活抗氧化酶。苹果属观赏海棠中编码磷脂酶A的基因对O3高度敏感。McWRKY75是响应O3胁迫的关键转录因子，其转录水平与类黄酮相关结构基因（McC4H，McDFR和McANR）呈正相关。乙烯响应因子McERF019和McERF109-like也被O3上调。外源茉莉酸甲酯（MeJA）降低了O3对海棠的伤害作用，并且在200 μmol L-1时最有效。MeJA处理改变了O3胁迫下海棠的代谢途径。尤其是，MeJA激活了苹果属植物中的类黄酮代谢途径，从而改善了其对O3胁迫的抵抗力。
论文ID
原名：How does Malus crabapple resist ozone? Transcriptomics and metabolomics analyses
译 名：苹果属观赏海棠如何抵抗臭氧？转录组学和代谢组学分析
期刊：Ecotoxicology and Environmental Safety
IF：4.872
发表时间：2020.6
通讯作者：陈学森，王延玲
通讯作者单位：山东农业大学
DOI号：10.1016/j.ecoenv.2020.110832
实验设计
结果
1 叶表型
图1.不同浓度（0、50、100和200 μmol L-1）的茉莉酸甲酯（MeJA）对暴露于O3的苹果属海棠叶片的伤害程度的影响。用MeJA喷洒幼苗的叶片，直到溶液从叶片上滴下来。22 h后，使植物经受O3胁迫（300 nL L-1持续3 h）。然后，使植物在环境空气中恢复24 h。在O3胁迫后3 h获取图像，叶片显示出典型的损伤。从左到右：正常生长状态；200 μmol L-1 MeJA处理；在O3胁迫下进行0 μmol L-1 MeJA处理；在O3胁迫下进行50 μmol L-1 MeJA处理；在O3胁迫下进行100 μmol L-1 MeJA处理；在O3胁迫下进行200 μmol L-1 MeJA处理。
2 生理生化分析
在暴露于O3之前，在“Hongjiu”的叶子上喷洒不同浓度的MeJA会显著影响花青素水平，但不影响chl含量（chl a，chl b和总chl）。但是，O3处理后，chl含量随时间下降。与暴露前的水平相比，处理后24 h，chl a，chl b和总chl含量分别降低了56.27％，25.11％和43.30％（图2A）。花青素含量先增加然后减少，在O3处理后12 h达到峰值增加61.72％，然后减少（图2B）。用MeJA喷洒以剂量依赖的方式减轻了O3胁迫引起的chl降解。最有效的MeJA浓度为200μmol L-1（图2A）。在此浓度下，与未经MeJA处理的幼苗相比，苹果属海棠幼苗的花青素含量增加了55.00％（图2B）。
随着O3处理时间的延长，SOD和POD活性先增加后减少，在12 h时，与处理前水平相比达到的峰值分别增加了62.17％和22.92％（图2C）。MeJA的施用在O3胁迫之前和之后均增加了“Hongjiu”叶片中的SOD和POD活性，其中以200 μmol L-1的MeJA处理的植物叶片中SOD和POD活性最高。与对照幼苗（未进行MeJA处理）相比，O3处理后12 h，那些用200 μmol L-1 MeJA处理的幼苗显示出11.07％的高SOD活性和30.51％的高POD活性（图2C）。
在未进行O3处理的情况下，将MeJA喷洒在苹果属海棠幼苗上，不会显著影响其MDA含量。在O3胁迫后，未施用MeJA的幼苗的MDA含量显著增加（P <0.05），而施用MeJA的幼苗积累的MDA较少。然而，在以100和200 μmol L-1的MeJA处理的幼苗之间，MDA含量没有显著差异（图2D）。
作者进行了两因素方差分析，以确定O3暴露后的时间与MeJA浓度之间的相互作用是否影响苹果属海棠的生理和生化特性。它们之间的相互作用仅显著影响了chl a和总chl含量（表S2）。
图2 O3暴露对苹果属海棠幼苗生理特性的影响以及不同浓度（0、50、100和200 μmol L-1）下茉莉酸甲酯（MeJA）的缓解作用。对（A）chl含量（chla，chl b和总chl），（B）花青素含量，（C）超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性以及（D）丙二醛（MDA）含量的影响。数据为三个试验的平均值±标准偏差（SD）。柱上方的不同小写字母表示在每个时间点的处理之间存在显著差异（P <0.05；Duncan法多重极差检验）。用MeJA喷洒3月龄的苹果属海棠苗，直到溶液从叶上滴下。然后，在22 h后，将它们暴露于300 nL L-1 O3的单剂量中3 h。使植物在环境空气中恢复24 h。在此过程中，在3、6、12和24 h检测了生理特性，其中0 h表示在O3处理之前即刻取样。每个样品是来自15株幼苗的随机样品的混合物。每个实验重复三次。
3 处理组之间的主要转录组差异
对过滤后的高质量片段进行测序，然后定位到参考基因组，以获得位置信息以及测序样品特有的序列信息。样品与参考序列的比率范围为86.38％–91.49％。根据比对结果，分析了编码蛋白质基因的表达水平。使用标准FC> 2和P <0.05，在第2组对第1组中检测到13,814个DEG（6800上调，下调7014），在第3组对第2组中检测到494个DEG（158个上调和336下调），两个比较组之间共享316个DEG（图3A和B）。总共选择了15个DEG用于qRT-PCR定量实验，以验证转录组测序的准确性。qPCR和RNA测序数据之间的相关性分别高达97％和92％（图S1），表明转录组数据的可靠性。
图3 不同比较组之间差异表达基因（DEG）的层次聚类分析。第1、2和3组分别是正常生长的植物，O3胁迫的植物（300 nL L-1 O3处理3 h后12 h）和MeJA（200 μmol L-1）处理后的O3胁迫植物。（A）组1和2之间（左）和组2和3之间（右）的重要DEG。在第1组与第3组的比较中对DEG进行GO术语富集分析的（B）层次聚类分析和（C）功能分类。第2组与第3组的比较中DEG的GO术语富集分析的层次聚类分析（D）和（E）功能分类。
4 O3胁迫下差异表达的转录因子基因
在O3胁迫下，13814个DEG中有463个被标记为转录因子（TF），其中包括WRKY，MYB和bHLH家族的成员以及乙烯响应因子（ERF）。它们大多数在O3胁迫下被上调（表1），表明这些TF主要通过正反馈调节对O3胁迫作出响应。在本实验中，在O3胁迫后，编码与胁迫抗性相关的TF的基因的转录本丰度发生了显著变化，如MYB，bHLH和WRKY（表1）。在O3胁迫下，WRKY家族中的许多基因被重编程并被高度诱导，尤其是McWRKY75（LOC103437525），其上调了871倍（表1）。McWRKY75的转录水平与类黄酮生物合成结构基因McC4H（LOC103447265），McANR（LOC114827797）和McDFR（LOC103450464）的转录水平呈高度正相关，相关系数分别为0.96、0.94和0.93（表S3）。因此，McWRKY75可通过正向调节类黄酮代谢参与对O3胁迫的抗性。使用NCBI的BLAST进行的序列比对分析表明，McWRKY75氨基酸序列与梨的WRKY75和WRKY43分别具有100％和83％的同源性（图S2）。核苷酸序列分析表明，McWRKY75含有W-box（TTGACT）结构。在对照样品中未检测到McERF019（LOC114826627），McERF109-like（LOC103416010）和其他与ET合成相关的基因的转录本，但在暴露于O3胁迫后被强烈检测到（表1）。McERF019和McERF109-like的核苷酸序列均包含一个G-box（GCCGCC），这表明ET参与了O3胁迫响应的特异性。这些结果表明，ET在苹果属海棠对O3胁迫的响应中起着重要作用，并通过与其他TF中的G-box相互作用来响应O3信号。
表1 与植物胁迫和O3响应相关的选定基因的转录水平。
5 对O3响应的可能机制和途径
使用GO富集对DEG进行分类。在生物学功能类别中，以下术语得到了显著富集：气孔开放的负调控（GO：1902457），阴离子通道活性的正调控（GO：1901529），赤霉素生物合成过程的正调控（GO：0010372），麦芽糖代谢过程（GO：0000023），磷脂稳态（GO：0055091）和甘油三酸酯稳态（GO：0070328）（图3C）。这些结果表明，O3通过气孔进入植物，并在保卫细胞信号转导途径中靶向阴离子以调节气孔的收缩或关闭。信号下游的植物激素转导途径响应外界刺激而调节基因转录，这影响了植物的新陈代谢。磷脂调节途径在抵抗O3胁迫中也起着重要作用。DEG分析显示，有15种磷脂酶A（PLA），9种磷脂酶C（PLC）和6种磷脂酶D（PLD）基因在响应O3的转录水平上表现出显著差异，PLA相关基因的转录水平差异最大（表S4）。这些结果表明，O3暴露会导致苹果属海棠中PLA的激活，尤其是PLA1的激活，并证实PLA是该植物对O3暴露响应中最重要的磷脂酶。这一发现对于进一步研究抵御O3胁迫的机制具有重要意义。
在细胞功能类别中，显著富集的术语是叶绿体类囊体膜蛋白复合物（GO：0098807），叶绿体光系统I（GO：0030093），镁螯合酶复合物（GO：0010007）和内质网膜的固有成分（GO：0031227）（图3C）。这些发现表明，O3破坏植物细胞，ROS累积在叶绿体中，光合作用受到抑制，并诱导内质网应激响应。
在分子功能类别中，显著富集的术语与酶和跨膜转运功能有关，包括H2O2脱水酶活性（GO：0047987），柚皮素查尔酮合酶活性（GO：0016210）和烟碱酰胺酶活性（GO：0008936）（图3C）。这表明H2O2是苹果属海棠暴露于O3后产生的ROS的主要形式，H2O2的积累会破坏植物组织。但是，ROS的积累可以通过抗氧化酶的活化得到改善。这可以迅速降低ROS含量，从而进一步增强苹果属海棠抵抗O3胁迫的能力。
6 MeJA介导的苹果属海棠的O3胁迫响应
在O3胁迫条件下，对MeJA预处理和非MeJA处理的样本进行了DEG表达分析。根据标准FC > 2和P <0.05，筛选了494个DEG，包括在O3胁迫下的158个上调和336个下调的DEG（图3A，D）。这些结果表明，MeJA触发了对苹果属海棠中O3胁迫的负反馈调节。这些DEG的功能分类显示，蔗糖的生物合成过程（GO：0005986），蔗糖-磷酸合酶活性（GO：0046524），次级代谢物的生物合成过程（GO：0044550），对脱落酸（ABA）（GO：0009737）和膜（GO：0016020）响应被上调，而类黄酮生物合成过程（GO：0009813），生长素分解代谢过程（GO：0009852）和SA分解代谢过程（GO：0046244）被下调（图3E）。这些结果表明，MeJA增强了O3胁迫下苹果属海棠组织的能量供应，并促进了膜或质膜对有害物质的过滤。这主要取决于次级代谢，尤其是类黄酮代谢和激素级联途径。此外，本研究结果还表明，在Me3处理的O3胁迫下，亚铁原卟啉结合（GO：0020037）和铁结合（GO：0005506）的功能被显著富集和上调（图3E）。涉及这些功能的基因属于细胞色素P450（CYP450）家族，这意味着MeJA还通过调节细胞色素途径参与了解毒。因此，外源MeJA可以控制氧化还原信号通路，减少氧化应激响应，并使植物能够快速适应环境变化。
7 O3胁迫和MeJA引起的代谢差异
在分析DEM之前，进行了主成分分析（PCA），以检测组之间和组内部的差异程度。如图S3A所示，解释了66.67％的变化的PC1，将O3处理的样品与未处理的样品分离开，表明在O3暴露胁迫后植物代谢发生了显著变化。PC2解释了总变化的10.52％，这归因于处理误差。同样，在O3胁迫条件下，MeJA预处理样品和非MeJA处理样品（PC1）之间的差异占代谢物变化的45.78％，而PC2则占总变化的23.69％，这主要是由于个体之间基因型的差异（图S3B）。为了进一步了解O3引起的苹果属海棠的代谢变化，使用UPLC-MS/MS平台检测了726种代谢产物。使用多种统计方法分析了样品组之间的代谢物差异。与正常的生长条件相比，在暴露于O3后，苹果属海棠中的142种代谢产物（115种上调和27种下调）显著变化（图4A和B）。其中，使用KEGG富集对67个DEM进行分类，并分配给102个代谢途径。主要途径是类黄酮生物合成（ko00941），然后是苯丙烷类生物合成（ko00940）和花青素生物合成（ko00942）（图4C）。这些结果表明，O3胁迫主要引起次级代谢紊乱，尤其是在类黄酮生物合成途径中。
如图4A所示，在暴露于O3之后，在经过MeJA预处理和未经MeJA处理的样品组之间进行DEM分析。总共鉴定了29个DEM（15个上调和14个下调）（图4A，D）。其中，有20种代谢物被分配到44个代谢途径。最显著富集的途径是蛋白质的消化和吸收（ko04974），类黄酮生物合成（ko00941）和氨基酸的生物合成（ko01230）（图4E）。这表明MeJA通过影响氨基酸和蛋白质的合成以及参与次级代谢途径来介导海棠对O3胁迫的反应。第2组对第1组和第3组对第2组的比较中，类黄酮的生物合成途径均被显著富集（图4A，E）。这表明类黄酮的生物合成不仅是对O3的响应所涉及的代谢途径，而且是外源MeJA激活的关键途径。
图4 不同比较组之间差异表达代谢物（DEM）的层次聚类分析。第1、2和3组分别是正常生长样品，O3胁迫样品（300 nL L-1 O3处理3 h后12 h）和MeJA（200 μmol L-1）处理后O3胁迫样品。（A）第1组和第2组之间（左）以及第2组和第3组之间（右）的重要DEM。第1组与第3组比较中DEM的（B）层次聚类分析和（C）KEGG途径富集分析。第2组与第3组比较重DEM的（D）层次聚类分析和（E）KEG通路富集分析。
8 基因和代谢物共表达分析
由于在第2组对第1组与第3组对第2组之间的比较中，类黄酮的生物合成途径被显著富集，因此作者在两个比较组中分析了与类黄酮生物合成相关的DEG和DEM之间的相关性。在第2组与第1组的比较中，检测到40个调节11种代谢产物的基因。在第3组与第2组的比较中，检测到9个调节4种代谢物的基因。通过选择Pearson相关系数大于0.8的DEG和DEM来构建相关图（图S4）。这些DEG和DEM用于构建苹果属海棠对O3防御机制的模型（图5）。
图5 示意性模型说明了海棠对O3胁迫的防御机制。
讨论
1 苹果属海棠响应于O3胁迫的生理机制
当植物受到生物和环境胁迫时，它们的组织和器官通常表现出明显的局部症状，包括斑点。本研究中，暴露于O3的苹果属海棠叶片严重受损（图1）。在被锈病感染的苹果叶片和暴露于O3胁迫的拟南芥叶片中也观察到了相似的结果。用MeJA预处理可减少由O3引起的损伤，并且叶片颜色从绿色变为紫色（图1）。这是因为MeJA增加了花青素含量，这可能保护了光合作用机制并减少了由O3暴露引起的ROS引起的细胞损伤。这种色素形成的变化表明了潜在的防御机制，并提供了有关如何在植物发育过程中控制胁迫的线索。
自工业时代以来，全球范围内的O3浓度一直在上升。最近，O3已成为影响植物尤其是树木的最广泛和有害的空气污染物。本研究发现300 nL L-1 O3对苹果属海棠幼苗造成了明显的叶面损伤（图1），并降低了叶片中的chl a，chl b和总chl含量（图2A）。MeJA的施用改善了O3胁迫下chl的损失（图2A），这表明MeJA可以帮助在O3胁迫期间保持完整的chl结构，从而降低植物对O3的敏感性。因此，MeJA处理可以改善植物的光合作用并减轻O3引起的损伤，这与其他研究结果一致。花青素是可以防止光抑制和清除自由基，从而保护chl结构的色素，使植物在O3胁迫条件下保持较高的光合作用速率。在本研究中，O3处理结束后12 h，苹果属海棠叶片的花青素含量增加了61.72％，而用MeJA预处理的幼苗的叶片中的花青素含量比未用MeJA处理的幼苗的叶片中的花青素含量高55.00％（图2B）。色素比例的变化导致植物颜色的变化，这也解释了为什么O3或MeJA处理会改变叶片的颜色。在以前的研究中也发现了类似的结果。另外，当植物受到生物和非生物胁迫时，花青素参与与植物抗性涉及的防御途径有关的次级响应。正如作者先前的研究所确定并得到本研究结果的支持，MeJA可通过调节花青素合成来介导植物防御反应。
植物已经进化出耐受机制来维持细胞平衡并抵抗由生物和非生物胁迫引起的损伤。ROS含量和抗氧化酶活性之间的平衡是维持植物组织中氧化平衡的关键。O3处理后，SOD和POD活性随时间先增加，然后降低（图2C）。这表明在胁迫暴露的早期，O3胁迫会激活植物中的抗氧化酶。SOD清除了超氧化物，POD清除了H2O2。因此，SOD和POD活性可以减少O3造成的损害。O3处理后，SOD和POD在抗氧化系统中均起着重要作用。在后期的胁迫暴露阶段，由于严重的细胞损伤，防御酶和其他非酶类抗氧化剂可能无法完全保护免受O3造成的损伤；因此，SOD和POD活性降低。本研究发现MeJA的使用增加了SOD和POD的活性（图2C），这表明外源MeJA可以通过增强抗氧化酶的活性来降低植物对O3的敏感性。在其他研究中也发现了类似的结果。
当植物遇到外部胁迫但无法解决时，会对细胞产生氧化损伤，从而导致脂质过氧化和MDA产生。在这里，在300 nL L-1下进行3 h的O3处理会增加苹果属海棠叶片中MDA的含量，表明具有破坏作用（图2D）。这类似于O3对烟草的影响。在暴露于O3胁迫之前喷洒不同浓度MeJA对MDA含量没有显著影响。但是，MeJA处理在O3处理后导致MDA含量存在显著差异，最佳MeJA浓度为100 μmol L-1和200 μmol L-1（图2D）。因此，外源MeJA通过增强细胞的抗氧化能力来帮助维持细胞完整性，这可以降低植物对非生物胁迫的敏感性，包括O3。
2 苹果属海棠对O3的转录响应
转录因子是植物发育和对外部刺激响应的主要调节因子，AP2/ERF，bHLH，MYB，NAC和WRKY基因家族的转录因子参与植物生物和非生物胁迫响应。特别是，WRKY TF可通过参与O3感知/信号转导的基因来诱导。WRKY家族的成员在植物抵抗O3方面起着重要作用。在此，WRKY TF是在O3条件下DEG数量最多的TF家族，表明该家族成员在海棠对O3胁迫的响应中起着不可或缺的作用。暴露于O3后，McWRKY75的转录水平显著增加（表1）。McWRKY75的核苷酸序列包含一个W-box特征结构，该特征结构与其他TF基因的启动子相互作用以调节其转录水平。这表明McWRKY75作为激活其他调控因子的信号分子，或者与其他蛋白质相互作用。此外，WRKY TF参与次级代谢的调节。已知它们可调节花青素和类黄酮的合成，这些花青素和类黄酮参与植物对O3的响应。在本研究中，McWRKY75的转录水平与类黄酮途径中的结构基因的转录水平显著正相关，包括McC4H，McDFR和McANR（表S3）。这表明McWRKY75调节类黄酮代谢途径中的各种基因，以控制O3的解毒。
AP2/ERF家族是参与非生物胁迫响应的成员最多的TF家族。在植物中，这些TF参与了对大多数非生物胁迫的响应，例如盐，干旱，高温和寒冷，并且是氧化还原反应基因网络的关键调节因子。但是，关于AP2/ERF在植物O3响应中的作用知之甚少。在此，暴露于O3后，AP2/ERF家族中的许多基因均被上调，这与O3条件下小白菜中AP2/ERF的表达一致。在本研究中，苹果属海棠叶片中的McERF019和McERF109样转录物水平在正常生长期间非常低，但是在暴露于O3后非常高（表1）。这表明McERF019和McERF109-like特别参与了对O3的响应，它们可以快速接收刺激信号并向下游传输。序列分析表明两者都含有一个G-box，它是启动子相互作用的响应元件。这些发现表明，McERF019和McERF109-like并非单独起作用，而是与其他TF相互作用以调节对O3胁迫的下游基因响应。
在植物中，O3直接干预叶片表面组织，或通过气孔到达叶肉细胞，并立即降解为ROS。本研究发现许多DEG参与了气孔的负调节（图3C）。保卫细胞中存在的阴离子作为信号受体，通过气孔限制来调节气孔关闭并控制O3进入细胞。O3一旦进入细胞，就会分解成ROS或诱导ROS形成，从而导致H2O2在叶绿体中积累。这类似于拟南芥在O3胁迫下的反应。本研究观察到，ROS在叶绿体中的积累显著抑制了叶绿体光系统的正常功能，从而降低了叶片的光合作用。但是，还检测到叶绿体类囊体膜蛋白复合物和镁螯合的增加，增强了O3胁迫条件下植物的光合作用效率（图3C）。这表明，根据以前的研究结果，细胞内类囊体蛋白可以解除O3毒性。
磷脂不仅在细胞膜结构中起关键作用，而且在细胞调节和信号转导中也起关键作用。其中，PLA，PLC和PLD是植物胁迫响应介导的关键因素。尚未有通过O3暴露直接激活磷脂酶的报道。在本研究中，PLA是响应于O3暴露而在苹果属海棠中上调的主要磷脂酶基因（表S4）。其他研究表明，PLC和PLD分别在对紫外线B和高温的响应起主要作用。因此，不同的磷脂酶在响应于不同的环境条件下的植物细胞中起关键作用。磷脂酶A催化膜磷酸甘油脂的水解，产生游离脂肪酸，包括亚麻酸。这些游离脂肪酸随后被下游代谢酶转化为具有生物活性的氧化脂质化合物，例如JA及其衍生物，它们是关键的植物激素。因此，作者假设苹果属海棠中的PLA通过参与JA生物合成来响应O3胁迫条件。
3 苹果属海棠对O3的代谢机制
蔗糖不仅是植物中的营养物，还是信号分子。蔗糖信号直接或通过激素和氧化还原过程调节植物对外部胁迫的响应。与未处理的苹果属海棠相比，用MeJA处理后在O3胁迫后显示出增强的蔗糖生物合成（图4E）。蔗糖水平的增加增加了细胞的渗透潜能，减少了O3对细胞的损害，并为植物生长或物质运输提供了能量。但是，特定的蔗糖信号转导途径也参与花青素的合成。因此，蔗糖通过调节花青素的合成参与了对O3胁迫的抗性。蔗糖磷酸合酶限制了蔗糖的合成步骤，调节了细胞质的蔗糖水平，并使蔗糖保持在最有利于植物生长的水平。糖酵解的产物是各种氨基酸合成的底物，MeJA通过调节糖代谢和间接调节氨基酸代谢参与O3解毒。
氨基酸是蛋白质的组成部分，是各种代谢和调节途径的主要参与者。通过促进特定氨基酸及其衍生物的积累，将外源植物激素施用于植物可以提高其对不利环境条件的耐受性。在这项研究中，MeJA的外源施用导致了O3胁迫条件下氨基酸的显著富集（图4E），类似于在盐胁迫条件下JA施用的结果。MeJA处理对不同氨基酸含量的影响不同。氨基酸是蛋白质合成的前体，是维持细胞动态平衡所必需的。但是，不同的氨基酸具有不同的功能。响应胁迫而合成的特定蛋白质将消耗某些氨基酸，从而导致其在细胞中的游离水平降低，以及蛋白质合成中未消耗的氨基酸积累。游离氨基酸含量进一步影响次次级谢过程，例如苯丙烷，生物碱和木质素的产生，它们也参与植物的胁迫响应。
在植物中，类黄酮是具有多种生物活性的次生代谢产物。它们广泛参与各种胁迫响应，并由多种植物激素诱导，例如SA，ABA和JA。研究发现，在O3胁迫条件下，与对照组相比，MeJA处理组的类黄酮代谢途径被显著富集（图4E）。该途径中的大多数基因均被下调，但它们的代谢产物被显著上调，如二氢黄酮类和花青素。这可能是由于转录水平和转录后水平的调控差异所致。尽管大多数基因被下调，但上调的基因最终决定了类黄酮代谢物的水平。尽管类黄酮的积累增强了对外界胁迫的抗性，但类黄酮水平的降低对植物也可能是有利的。类黄酮可以进行单电子氧化以直接淬灭自由基，从而成为ROS的次级清除剂。尽管类黄酮水平的降低主要是由于类黄酮降解引起的，但是甲基化和糖基化可以将活性类黄酮转化为稳定的糖苷形式，这也降低了类黄酮的含量。类黄酮与生物膜相互作用，使它们对许多氧化因子具有更强的抗性，从而降低了它们的流动性并防止自由基扩散。先前的研究表明，MeJA可以诱导CYP450家族基因的表达，其中一些促进类黄酮代谢。在本研究中，与未经处理的样品相比，经MeJA处理的样品在O3胁迫条件下显示除CYP450基因家族的显著富集。因此，MeJA通过调节细胞色素途径直接或间接调节类黄酮代谢的动态平衡，这是MeJA介导的抵抗O3胁迫的关键。
植物激素在植物生长以及防御和免疫反应中起着关键作用，但它们并不是唯一参与干扰外部胁迫的分子。在本研究中，O3胁迫条件下，外源MeJA增加了调节ABA的TF的表达水平，同时限制了SA分解代谢（图4E）。这些发现表明JA和ABA以协同方式响应O3胁迫。本研究结果还表明，MeJA通过抑制SA分解代谢而不是调节SA合成代谢来增强苹果属海棠抵抗O3的能力。由于O3暴露会导致ABA积累，因此JA增强的ABA信号转导可以进一步增强ABA对气孔关闭和下游信号传递的调节强度。先前的研究表明，在低SA浓度下，SA和ET/JA介导的防御信号通路具有协同作用，而在高SA浓度下，它们具有拮抗作用。JA抑制SA分解代谢，这表明在非胁迫条件下植物中SA的含量相对较低。植物维持激素之间的动态平衡，这使它们能够以相互关联的方式限制由O3引起的植物损伤以及O3在植物中的转移。但是，由于植物防御调控网络的复杂性，外源植物激素介导的植物对O3胁迫的抗性的具体机制仍不清楚。
结论
本研究结果表明300 nL L-1 O3持续暴露3 h对苹果属海棠幼苗造成严重损伤。色素的变化和抗氧化系统的激活是苹果属海棠抵抗O3胁迫的主要生理防御机制。另外，O3通过气孔限制而降解并诱导形成ROS，并且ROS主要以H2O2形式积累在叶绿体中。磷脂酶A是植物中响应O3活化的主要磷脂酶，它通过催化作用向下游传递信号。编码调节对O3胁迫响应的一个关键TF McWRKY75，以及两个O3特异ET TF，McERF019和McERF109-like，在O3胁迫下也被上调。研究发现，外源MeJA的施用可以增加苹果属海棠对O3胁迫的抵抗力，最有效的MeJA浓度为200 μmol L-1。结果还表明，外源MeJA促进了暴露于O3的苹果属海棠中蔗糖的生物合成，并直接或间接调节激素信号转导，氨基酸代谢和类黄酮代谢。这些响应共同提高了苹果属海棠对O3胁迫的抵抗力。类黄酮代谢途径的激活不仅有效增强了苹果属植物对O3胁迫的抗性，而且还由MeJA介导。
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