编译：夕夕，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
真核藻类的新陈代谢、细胞循环周期和相关转录本会随昼夜变化而变化。在单细胞红藻中，S期和M期在夜间发生。为研究代谢途径中昼夜变化进而影响的转录组变化与细胞周期的关系并鉴定细胞周期中在转录水平变化的所有基因，作者对研究了C.merolae昼夜变化上转录水平的差异。此外，作者比较了野生型和转基因之间的转录水平的变化。在4775个核编码基因中，野生型中有1979个基因在转录水平表现出随昼夜变化转录本变化，这表明这些基因的表达取决于细胞周期的进程。除涉及淀粉降解和三磷酸脱氧核糖核苷酸合成的基因外，大多数代谢基因的周期表达模式在转基因系中均未受到影响，这表明大多数代谢途径中的细胞周期和转录组变化均与昼夜变化无关。大约40％的细胞周期依赖性基因功能未知，这些功能未知基因的大约19％与绿藻衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）共享。 本研究中提供的数据集将有助于进一步研究真核藻细胞的细胞周期及其与代谢的关系。
原名：Relationship between Cell Cycle and Diel Transcriptomic Changes in Metabolism in a Unicellular Red Alga
译名：单细胞红藻细胞周期与代谢昼夜转录变化的关系
期刊：Plant Physiology
IF:12.5
发表时间：2020.8
通讯作者：Takayuki Fujiwara
通讯作者单位: Department of Gene Function and Phenomics, National Institute of Genetics, Mishima, Shizuoka 411–8540, Japan
DOI号：10.1104/pp.20.00469
1 在C. merolae的4775个核编码基因中，其中周期性约为24小时的1,979个基因为全面鉴定C. merolae中细胞周期依赖性基因并了解细胞周期进程与代谢基因的mRNA水平变化之间的关系，作者首先确定了在LD（光照12h，黑暗12h)下周期约为24 h的基因。随后，作者通过比较野生型和转基因型LD下的基因表达模式来提取细胞周期依赖性基因。为了全面鉴定在大约24小时（LD）周期内其mRNA水平发生变化的C. merolae中的核编码基因，作者使用微阵列分析研究转录组学变化。在LD下，将C. merolae细胞培养在无机光合自养培养基中，并分析第二轮LD期间的转录组变化。作者在28小时内从四个相同重复培养物中的每个进行了采样，每个样品的采样日期不同，共设置四个生物学重复。使用这种实验设计，而不是更长的48小时时间，以避免由于细胞生长导致的无机营养减少以及由于细胞数量增加而导致的每个细胞的光利用率降低，从而避免了两轮LD之间的转录组差异。在作者先前的研究中，使用了LD下的另一组野生型转录组数据，作者只关注与碳固定，糖酵解，呼吸作用有关的某些基因的mRNA水平变化， 和野生型细胞周期的进展。通过设置阈值FDR为0.05和FC为2，在4775个和编码基因中，共鉴定到了1979个在LD为24小时的周期内表现出了转录水平的变化。2 在LD下具有大约24小时周期性的1,979个基因的分类和功能注释与之前的研究一致，细胞周期相关的基因，如涉及染色体复制和分离的基因，表现出清晰的24小时节律，并在8至16小时内积累。值得注意的是，在C.merolae中在mRNA水平上S期的一些基因例如PCNA在8h或8-12h时到达峰值，而相应的蛋白质表达在12h开始表达。因此，C.merolae的S期处于黑暗早期。为了全面了解野生型LD下的转录组变化情况，作者将上述鉴定出的具有周期性24h的基因根据表达的相似性进行k-means聚类（图1）。并通过KEGG对每个类中的基因进行功能注释和分类。Cluster 1主要包括mRNA水平在0小时左右升高、12小时左右降低的基因。Cluster2,3,4,5主要是mRNA表达水平分别在0-4h，4-8h，8-12h和12-16h（图1B），其中cluster4和cluster5的mRNA水平变化大于其他组（图1B）。通过KEGG注释和分类，5组分别有13%，31%，31%，18%和7%的基因被划分为代谢途径（图1C）。在cluster2中，1代表碳水化合物代谢，2代表能量代谢，8代表辅助因子和维生素代谢，9代表萜类和聚酮类代谢，富集到这些途径的基因显著富集。在cluster3中，富集到2，6代表其他氨基酸代谢和8的基因显著富集（图1C）。相比之下，在cluster1，4和5中基因没有显著富集到代谢途径（图1C）。这些结果反映了在光自养条件下，细胞只在光照期生长，而在LD条件下，在黑暗期，细胞核DNA复制发生在S期的早期。
图1 C.merolae中4775个核编码基因的LD下的1,979个基因的描述3 在HA-CDKA-cKD株中，G1期因敲除CDKA而停止许多藻类的细胞周期与LD有关，并且在某些物种中，表明细胞周期的进程受昼夜节律的调节。因此，要解剖那些表达模式依赖于细胞周期进展而不是LD或昼夜节律的基因，就必须将细胞周期进展与LD分开。作者计划敲除CDK，CDK是真核生物中细胞周期进程的主要调节者。由于CDK对细胞增殖至关重要，因此作者采用了以前开发的有条件的基因敲低系统。除常规的CDK（CDKA）外，植物和藻类还具有CDKB，其在S / M阶段特别表达，并参与G2 / M过渡。在本研究中，作者通过敲除CDKA使细胞停滞在G1期（图2）。在CDKA开放阅读框（ORF; CME119C）的起始密码子之后添加33HA表位编码序列，以使用抗HA抗体检测蛋白质。硝酸还原酶基因NR的氨抑制启动子与HA-CDKA ORF融合。然后，将构建体整合到C.merolae的染色体CDKA基因座中，从而可以通过所得HA-CDKA-cKD菌株中培养基中铵的存在（关闭）或不存在（开启）来控制内源CDKA表达（图 2A）。此外，为了比较贫铵培养基中HA-CDKA-cKD菌株中NR启动子表达的HA-CDKA水平与野生型菌株中内源CDKA启动子表达的水平，作者还制备了该菌株 HA-CDKA，其中仅在染色体CDKA ORF的起始密码子之后整合了HA编码序列（图2A）。将HA-CDKA和HA-CDKA-cKD菌株在贫铵的无机培养基中连续光照下异步培养，该培养基含有硝酸盐而不是铵盐作为唯一的氮源。然后使用免疫印迹法检测HA-CDKA-cKD菌株中的HA-CDKA蛋白，其水平与HA-CDKA菌株中的蛋白水平相当（图2B）。当将菌株转移到含有氨作为唯一氮源的MA2培养基（NR启动子关闭）后，转移后2 天，HA-CDKA蛋白在HA-CDKA-cKD菌株中几乎消失，而在HA-CDKA菌株中没有消失（图2B）。因此，作者通过按预期改变培养基中的氮源（铵或硝酸盐）成功地控制了HA-CDKA-cKD菌株中HA-CDKA蛋白的积累和消耗。为了检查HA-CDKA-cKD菌株中CDKA的耗竭是否阻止了细胞周期进程，将细胞置于MA2和MA2-NO3中进行LD分析。在将培养物置于LD之前，将它们在黑暗中孵育1天以终止细胞生长，从而将HA-CDKA和HA-CDKA-cKD培养物中的细胞停滞在G1期，并耗尽HA-CDKA在HA-CDKA-cKD培养物中（图2C）。从第二个LD开始每隔4小时获取一次蛋白质样品，并进行免疫印迹（图2C）。在MA2-NO3培养基中，HA-CDKA蛋白在整个LD和α-微管蛋白中表达，α-微管蛋白在C. merolae的S和M期特异性表达在16至20小时内被检测到（图2C）。相比之下，在MA2培养基中，几乎在整个LD中均未检测到HA-CDKA和α-微管蛋白（图2C），这表明HA-CDKA-cKD细胞由于CDKA的耗尽而被阻滞在G1期。当以上述方式在MA2中的LD下培养野生型和HA-CDKA-cKD细胞时，在第二轮LD中，野生型培养物中的细胞数大约增加了一倍，而在 HA-CDKA-cKD培养物完全没有增加（图2D）。因为氮源的差异会导致细胞代谢状态的差异，从而导致代谢基因的mRNA水平的差异，所以在接下来的LD下转录组变化分析中，作者比较了野生型和HA-CDKA-cKD 株在MA2培养基中。在HA-CDKA-cKD的G1期停滞培养中，LD下不表达S / M期特异性基因（图2D），因此LD下细胞周期依赖性基因的表达模式与细胞周期无关的基因，有望与野生型培养的基因不同。
图2 由贫铵培养基驱动的C.merolae，G1期敲除CDKA4 通过比较野生型，G1期HA-CDKA-cKD和RBR-KO株的转录组分析，从1979个周期性基因中鉴定到454个细胞周期依赖基因为了在上述鉴定的LD下从1,979个周期为24 h的基因中提取细胞周期依赖性基因，作者对野生型菌株和G1期阻滞的HA-CDKA-cKD和RBR-KO进行了比较转录组分析。作者鉴定了在野生型和HA-CDKA-cKD和RBR-KO菌株之间的LD下表现出改变的表达模式的基因。比较是基于表达模式（相关系数），是LD下mRNA的平均水平以及LD下节律幅度的偏差。例如，在野生型菌株中，编码PSII组分的放氧复合物组分（PSBQ / CMC133C）的mRNA水平在8小时达到峰值，然后在黑暗期被下调（图3A）。在G1停滞的HA-CDKA-cKD和RBR-KO菌株中观察到了几乎相似的模式（图3A）。因此，LD下PSBQ mRNA水平的24小时节律与细胞周期进程无关。在野生型菌株中，α-微管蛋白（CMT504C）的mRNA水平在12至16 h达到峰值。然而，这种模式在G1停滞的HA-CDKA-cKD和RBR-KO菌株中被废除了（图3A）。在G1停滞的HA-CDKA-cKD菌株中，α-微管蛋白表达被完全抑制（图3A），与野生型菌株相比，RBR-KO菌株的表达模式发生了变化，其峰的时间分别移至0和24 h，节律幅度明显降低（图3A）。这些结果表明，野生型，HA-CDKA-cKD菌株和RBR-KO菌株之间的比较成功地鉴定了显示表达模式取决于细胞周期而不是LD的基因。基于对1797个周期为24h的基因分析，在HA-CDKA-cKD vs野生型组中，作者鉴定到了695个基因表现出受损表达模式。在RBR-KO vs野生型组中，作者鉴定到了635个基因表现出受损表达模式。其两组共有的基因为454个（图3B），作者将这454个基因定义为细胞周期依赖性基因。
图3 通过比较转录组分析评估24小时周期的细胞周期依赖性基因和LD依赖性但细胞周期非依赖性基因作者进一步尝试将454个细胞周期相关基因分为S / M期基因和G1期基因。分别将176和144个细胞周期依赖性基因（共320个）分为簇4和簇5，其中在LD下，mRNA水平在12至20 h达到峰值，这对应于S / M期。簇4和簇5包括编码DNA复制机制的基因（例如MCM6和PCNA），用于染色体分离的结构蛋白（例如编码缩合蛋白成分的基因），细胞周期调节剂（例如细胞周期蛋白和有丝分裂激酶）以及细胞器分裂蛋白。在454个依赖细胞周期的基因中，有45、47和42个基因被分为簇1、2和3，其mRNA水平分别在0、0至4和4至8 h达到峰值。对应于G1阶段。与S / M期基因（簇4和5中的细胞周期依赖性基因）相比，大多数G1期基因（簇1、2和3中的细胞周期依赖性基因）表现出较低的变化。在320个S / M期基因中，有171个（53％）基因在野生型（所有野生型1、2、3和4）中表现出超过10倍的振幅。相比之下，在簇1、2和3中的G1期基因（总共134个基因）中，只有四个，两个和两个基因（总共八个基因；6％）的幅度超过10倍。正如在其他真核藻中观察到的一样，许多代谢基因在LD下的表达谱为;24h周期性，大部分代谢基因在4至8 h达到峰值，它对应于LD下的发光周期（图1）。为了检查细胞周期进程与代谢基因转录组变化之间的关系，以及细胞周期进程如何影响代谢基因的表达，作者给细胞周期依赖性和非依赖性基因进行KEGG通路注释和分类（图4）。结果，将38个细胞周期依赖性周期性基因分配给了新陈代谢类别。在454个细胞周期依赖性基因的KEGG分类中，仅复制和修复类别显著富集。在38个依赖细胞周期的代谢基因中，有15个基因被分配给核苷酸代谢。大多数这些核苷酸代谢基因在8到12 h达到峰值，就像参与DNA复制的细胞周期依赖性基因一样。如后面所述，这些基因参与了DNA复制的dNTP合成，并且在S期之前和S期中这些基因的上调在G1停滞的HA-CDKA-cKD菌株中几乎被取消。在其余的23个代谢基因中，有9个基因被分配给碳水化合物代谢。与15个核苷酸代谢基因相比，G1停滞或RBR-KO对其余23个代谢基因的作用相对较弱。这些结果表明，除了在S期DNA复制中核苷酸代谢的那些代谢外，大多数代谢中的昼夜变化的转录组变化均与细胞周期无关。
在上述分析中，许多细胞周期依赖性代谢基因被分配给核苷酸代谢（图5）。通过比较转录组分析的，现与dNTP从头合成有关的关键酶的mRNA水平取决于细胞周期。核糖核苷二磷酸还原酶是a和b亚基的复合物（CMM323C，RNR-a; CML050C，RNR-b1），催化核糖核苷酸二磷酸转化为脱氧核糖核苷酸二磷酸，这是dNTP的限速步骤 生物合成途径。CMP / UMP激酶（CMT083C; CMPK3）催化（d）CMP和（d）CDP之间以及UMP和UDP之间的相互转换。CTP合酶相互转换UTP和CTP，用于dCTP和dTTP合成。dUTP焦磷酸酶参与dTTP合成。二氢叶酸还原酶和胸苷酸合酶的融合蛋白参与dTTP合成。在野生型中，这六个基因的mRNA水平在8至12 h达到峰值，而在G1停滞的HA-CDKA-cKD菌株中，其上调受到抑制。另外，RBR-KO菌株中的mRNA表达模式也受损（图5）。因此，这六个基因的mRNA水平取决于细胞周期进程。
图5 从头dNTP合成中涉及的基因的mRNA水平具有细胞周期依赖性变化G1停滞或RBR耗竭对除核苷酸代谢外的大多数细胞周期依赖性代谢基因的影响相对较弱。但是，作者发现与淀粉降解有关的两个基因受细胞周期进程的影响相对较大（图6）。糖原磷酸化酶（GPL）和异淀粉酶1（ISA1）参与淀粉的降解，GPL将糖原/淀粉分解为Glc-1-P并且是C. merolae中主要的淀粉颗粒结合蛋白。在野生型中，GPL mRNA水平在8至12 h达到峰值。相比之下，在G1捕获的HA-CDKA-cKD和RBR-KO菌株中，峰均移至16 h。此外，在HA-CDKA-cKD和RBR-KO中，峰的水平低于野生型，振幅分别为野生型的0.39和0.25倍（图6）。然而，在HA-CDKA-cKD中，ISA1 mRNA的表达从0小时增加到4小时后被抑制。此外，RBR-KO菌株中ISA1 mRNA的节律受到损害。这些结果表明，即使在没有G1 / S过渡的情况下，LD下GPL和ISA1 mRNA水平也会在0至4 h和0至16 h增加，并且通过G1 / S过渡会进一步增加。G1 / S转变时GPL和ISA1 mRNA水平上调的合理解释是，它产生更多的ATP来执行需要能量的核DNA复制和分离以及细胞器和细胞分裂。另一个合理的解释是，GPL和ISA1在S相上调，从而为磷酸戊糖途径提供Glc-6-P，后者又产生了5磷酸核糖，用于从头合成dNTP。
图6 细胞周期进程对淀粉降解相关基因mRNA水平的影响1 LD，昼夜节律变化在mRNA水平上与代谢基因和细胞周期进程的关系作者之前曾报道了在LD下对梅花弯曲杆菌同步培养的两个转录组分析。前者侧重于S和M期特异性基因的候选基因。后者主要关注转录组中与能量代谢有关的日常变化，例如糖酵解，呼吸作用和光合作用。然而，两项分析均未剖析细胞周期和LD对转录组变化的贡献。这种情况也适用于真核藻的diel转录组学变化的其他研究。因此，除了需要进一步检查的某些基因外，尚不清楚某个mRNA水平的大约24小时节律性变化是否是由细胞对LD的反应或细胞周期进程导致的。为了解决这个问题，在这项研究中，作者通过比较野生型，G1阻滞的HA-CDKA-cKD菌株和RBR-KO之间的表达模式，在LD下大约周期为24 h的基因中鉴定了细胞周期依赖性mRNA。在总共4775个核编码基因中，有1979个（41％）基因在作者的培养条件下表现出大约24小时的周期性表达模式。这些基因包括许多代谢途径中涉及的基因，其中大多数在白天达到峰值，而在染色体复制和细胞分裂中调节或起作用的基因则在LD的晚上到晚上达到峰值。根据作者的比较转录组分析，在周期为24小时的1,979个基因中，有454个被定义为依赖细胞周期的基因。在大多数代谢合成途径中这些与细胞周期无关的迪尔节律看来是合理的，如图7所示。白天通过光合作用使细胞生长相对缓慢，并且群体中只有一些细胞达到了细胞分裂所需的一定大小。
图7 C. merolae细胞周期进程与代谢转录组变化之间的关系作者已经确定了181个功能未知的细胞周期相关基因。在C. merolae中，叶绿体，线粒体，高尔基体和过氧化物酶体的分裂发生在S / M阶段，许多细胞器分裂基因在这些阶段特别表达。因此，对这些功能未知的细胞周期依赖性基因的进一步研究应有助于作者了解细胞周期进程和细胞器分裂的机制，以及光合作用的真核生物中细胞周期和光合细胞的生长如何协调。据报道，在赖氏梭菌中，总共约15,000个核编码基因中有1,719个基因依赖于CDKA和CDKB。通过BLASTP搜索，在C. merolae中的454个细胞周期依赖性基因中，在C. reinhardtii中发现了265个基因（58％）。但是，这些基因中只有77个依赖于C. reinhardtii中的CDKA和CDKB。这77个基因均依赖于C.merolae和C. reinhardtii中的细胞周期，它们编码众所周知的细胞周期相关蛋白，例如细胞周期调节剂和参与DNA复制，染色体分离，微管组织。通过BLASTP搜索，在功能未知的181个C.merolae依赖细胞周期的基因中，C.reinhardtii中发现了34个基因的同源物，C.reinhardtii中和陆地植物拟南芥中都发现了21个基因的同源物。在C.reinhardtii中34个未知功能的基因中，在LD下（补充数据集S1和S9; Zones等人，2015），14个基因的mRNA水平表现出; 24-h周期性，并且五个基因的表达取决于细胞周期。对这些基因的研究可能会为真核藻特异过程的细胞周期依赖性调节提供重要的见识。由于许多细胞周期依赖性基因对于细胞增殖是必不可少的，因此有条件的基因敲除和显性负性形式的条件表达与蛋白质有关。C. merolae应有助于细胞周期依赖性基因的分析。此外，在这项研究中，作者成功地将C. merolae细胞捕获在G1期，而没有通过条件性CDKA抑制光合细胞的生长。HA-CDKA-cKD菌株和此方法应在进一步研究中用于检查细胞周期进程，细胞生长，代谢节律和LD。在这项研究中，作者使用了芯片进行分析，因为该方法在开发RNA测序（RNA-seq）分析之前已经得到了很好的确立。但是，RNA-seq已成为分析未知转录本和剪接变体以及核糖体谱分析的强大工具。因此，通过RNA-seq对取决于昼夜节律和细胞周期的mRNA变化进行研究将为了解光合真核生物中昼夜和细胞周期依赖性过程提供更多信息。
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