科研 | Front Plant Sci：借助转录组研究海棠中调控原花青素合成的两个乙烯应答因子（国人作品）
编译：Yong-qin，编辑：十九、江舜尧。
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黄酮类化合物是植物体内重要的多酚类化合物，可分为三类：花青素、原花青素（PAs）、黄酮醇。原花青素，又称缩合单宁，是由儿茶酸和表儿茶酸合成。原花青素参与了植物对紫外光辐射的防护和对病原菌及害虫的防卫，同时具有抗氧化活性，对人体健康颇有益处。
无色花青素还原酶（LAR）和花青素还原酶（ANR）通过多步酶促反应来合成原花青素，属于核心类黄酮途径，在许多植物中有过研究。在苹果中，LAR和ANR的转录水平分别与儿茶酸和表儿茶酸的含量相关，说明在原花青素合成中发挥作用。海棠中发现了两个LAR基因和两个ANR基因，这四个基因的过表达会增加植物原花青素含量。研究表明参与类黄酮合成的基因受R2R3-MYB、bHLH、WD家族转录因子的调控。在苹果中，花青素合成通路由MdMYB1、MdMYB10、MdMYBA调控，低温诱导的MdbHLH3表达可与MdMYB1互作，促进花青素生物合成。这些相似的结论也在拟南芥、苜蓿、草莓中研究。此外，MdMYB9和MdMYB11基因可与MdbHLH3结合，作用于MdANS、MdANR、MdLAR启动子。在海棠中，McMYB12a和McMYB12b通过与原花青素生物合成基因的启动子结合，调控其合成。
越来越多的研究证明，存在其他调控基因影响原花青素的生物合成。例如，苹果中的一个BTB结构域蛋白（MdBT2）在原花青素合成中起负调控作用，MdBT2与MdMYB9结合，通过26S蛋白酶系统负调控MdMYB9蛋白的含量。同时，乙烯响应因子MdERF1B已被证明与MdMYB1、MdMYB9、MdMYB11结合，调节原花青素合成。因此，推测海棠中原花青素的生物合成可能涉及不同的转录因子调控。
海棠果实含丰富的花青素、黄酮醇、PAs，有利于研究PAs生物合成的分子机制。本研究利用RNA-seq分析不同发育阶段的海棠果实，找出原花青素合成的调控因子及共表达基因；利用瞬时转染和酵母杂交验证基因的功能。
论文ID
原名：Transcriptome Analysis Identifies Two Ethylene Response Factors That Regulate Proanthocyanidin Biosynthesis During Malus Crabapple Fruit Development
译名：海棠中调控原花青素合成的两个乙烯应答因子
期刊：Frontiers in Plant Science
IF：4.106
发表时间：2020.02
通讯作者：姚允聪
通讯作者单位：北京农学院植物科学技术学院
DOI号：10.3389/fpls.2020.00076
实验设计
① 植物材料。火焰海棠（Malus 'Flame’），采集5个发育阶段的果实液氮冻存。
② 生化测定。0.8-1.0 g冷冻样品进行HPLC分析，520 nm处检测花青素含量，280 nm处检测原花青素含量。同时，利用二甲基乙酰胺二甲基缩醛（DMACA）染色法测定叶片的原花青素含量。
③ RNA-seq。3 μg RNA进行150 – 200 bp cDNA建库测序。Bowtie2和TopHat进行参考序列比对，HTSeq计算基因表达水平，DESeq筛选差异表达基因。Blast2GO和KOBAS进行富集分析，WGCNA进行共表达分析。
③ 互作分析。根据筛选得到的两个乙烯应答因子构建载体，采用农杆菌渗透法在海棠植株中瞬时表达分析。酵母单杂交判断两个乙烯应答因子与原花青素生物合成相关的调控因子的相互作用。
结果
1、不同发育阶段的代谢差异和转录组差异
本研究比较了五个发育阶段的海棠果实（图1A），HPLC分析表明总原花青素B1/B2含量在发育中逐渐减少，而花青素仅在发育最后阶段被检测到（图1B）。RNA-seq表明黄酮类生物合成基因CHS、CHI、F3H等具差异表达特性，原花青素生物合成基因LAR、ANR随果实发育表达呈下调趋势（图1C）。
五个发育阶段的差异表达基因数目如图2A所示，多数基因与苯丙氨酸代谢、苯丙素生物合成、类黄酮生物合成、植物激素信号转导有关（图2B）。其中的植物激素信号转导基因包括生长素应答因子、乙烯应答因子等（图2C），ERS（乙烯反应传感因子）和ERF（乙烯响应因子）在果实发育后期表达显著上调。
2、基因共表达网络分析
对9471个差异表达基因进行共表达分析，得到17个表达模式（图3A），其中MElightcyan模式与原花青素B2的代谢模式高度相关，包含4297个基因，137个与植物激素信号转导有关，296个与转录相关（图3B）。转录相关的基因多为MYB、bHLH、ERF、ARF家族（图3B）。通过调控网络鉴定了较为重要的12个转录因子做进一步研究，均为MYB、bHLH、ERF家族（图3C）。这些基因为乙烯应答因子（ERF105、ERF023、RAP2-4、ERF1A、ERF5、RAV1、DREB1A、DREB1D、ERF1E、ERF061），MYB44，bHLH13（图4A）。RT-qPCR证明这12个基因在果实发育过程中表达下调，与RNA-seq结果相同（图4B和C）。
3、乙烯应答因子RAP2-4和RAV1的功能分析
本研究中RAP2-4和RAV1与原花青素的代谢相关性最大。构建这两个基因的克隆载体，在植物中过表达，利用DMACA染色体现原花青素含量。结果表明，RAP2-4过表达可提高叶片原花青素含量，而RAV1相反（图5A和B）。qPCR表明，RAP2-4促进McLAR1和McANR1的表达，而RAV1抑制McANR2的表达（图5C）。同时，在果实中过表达RAP2-4也导致原花青素积累（染色呈深蓝色），而RAV1相反（图5D和E）。qPCR表明RAP2-4促进McLAR1表达，而RAV1抑制McLAR2和McANR2表达（图5F）。综上，RAP2-4激活原花青素生物合成，而RAV1起抑制作用。酵母杂交分析表明，RAP2-4余McLAR1启动子结合，而RAV1与McANR2的启动子结合（图6）。
图5 RAP2-4和RAV1过表达在对植物原花青素合成的影响。
图6 酵母单杂交验证RAP2-4和RAV1与原花青素合成调控基因的互作。
讨论
PAs在许多植物组织尤其是果实中大量存在，在生理和发育上起重要作用。PAs是类黄酮途径的主要产物，对人体健康有许多益处。海棠果实中含有丰富的PAs化合物，是研究PAs生物合成的分子机制的有价值的模式植物。本研究通过HPLC分析发现海棠果实发育过程中，PAs在幼果中大量存在，与先前在香蕉果实中的研究相似，先前研究发现MaANR和MaLAR基因的表达水平与幼果PAs的积累有关。因此作者利用RNA-seq分析PAs在果实发育过程中生物合成的分子机制。
据研究报道，脱落酸、乙烯和茉莉酸促进植物花青素的合成，促进果实成熟，而生长素和赤霉素抑制花青素的合成，延缓果实成熟。此外，研究表明脱落酸信号促进了早期陆生植物的黄酮醇的生物合成（尤其是槲皮素衍生物），这些结果表明植物激素在果实发育和成熟过程中起重要作用，本研究同样发现了许多植物激素信号转导的基因在海棠果实中的差异表达。进一步分析发现生长素和乙烯信号参与了PAs的生物合成调控，其中包括乙烯响应因子（ERF转录因子）。与原花青素B2代谢相关性最高的基因表达模式表明，MYBs、bHLHs、ARFs家族转录因子可能参与了PAs的代谢，证明PAs的生物合成受多种转录因子调控。其中，MYB和bHLH转录因子是目前研究最全面的基因，在拟南芥、草莓、葡萄、柿子、苹果中广泛研究。海棠中MdARF13与MdMYB10可结合作用于MdDFR启动子，促进花青素生物合成，而MdERF1B则作用于MdMYB9和MdMYB11。本研究认同MYB、bHLH、ERF家族基因在海棠PAs生物合成调控中起重要作用，并通过共表达调控网络选择了12个重要基因进行后续研究。
乙烯是跃变型果实的主要促进成熟的激素，也参与调控类黄酮的生物合成。在葡萄果实中，外源乙烯的处理可诱导CHS、F3H、LDOX、UFGT基因的表达从而促进花青素的生物合成。苹果果实中，果实成熟的外源乙烯处理增加了果实内花青素含量，提高了相关酶的活性。然而，乙烯对果实成熟过程中的原花青素的积累是否有调控作用仍不清楚，具体的调控机制未有研究。
综上，原花青素的代谢受到许多转录因子的调控，研究较多的为MYB和bHLH基因家族，而本研究发现了除此之外的10个重要乙烯应答因子，并选择RAP2-4和RAV1做进一步研究。结论表明，这两个乙烯应答因子通过与原花青素调控基因的启动子结合，调控原花青素的积累和代谢。该结论表明乙烯应答因子对原花青素的生物合成起调控作用。
评论
该研究发现了植物原花青素代谢相关的10个乙烯应答基因，并证明了其中两个基因RAP2-4和RAV1的调控作用，RAP2-4起正调控作用，而RAV1则抑制原花青素的表达，促进了乙烯对原花青素的调控机制研究。
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