科研 | 兰花菌根真菌Tulasnella calospora与Serapias vomeracea共生期间的代谢组学调节
编译：榴莲，编辑：Emma、江舜尧。
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在自然界中，大多出陆地植物都会和共生真菌形成菌根。根据共生双方的形态和分类地位，分为四种主要的菌根类型，即丛枝菌根、外生菌根、类固醇菌根和兰花菌根。菌根真菌增加了寄主植物获得矿物营养、耐受生物和非生物压力的能力。作为交换，真菌获得植物光合作用产生的碳(C)作为能量来源，并得到一个受保护的生态位。兰花的特殊之处在于它们的种子中缺少胚乳。兰花共生真菌可以为发芽的种子提供有机碳和氮磷等营养物质。兰花种子发芽后会形成的原球茎。原球茎中形成细胞内菌丝圈（或果胶）。这可能是营养从真菌转移到寄主植物的原因。
最近，人们对兰花菌根中植物与微生物互作的分子基础进行了研究。基因表达谱已鉴定出与信号传导、种子发芽、真菌异养和植物防御有关的真菌和植物基因。此外，稳定同位素和分子分析的标记实验结果也集中于共生体之间的营养交换。
代谢组学是研究共生中代谢变化的另一种方法。代谢组学通过测定生物系统的低分子量补体，得到细胞生化状态的直接信息。虽然对兰科菌根的代谢物变化知之甚少，但一些植物次生代谢物可能在其相互作用中发挥作用。例如，最初在印度兰(luia indivisa)中抗真菌的二苯乙烯类化合物lusianthrin在红塞菌根原球茎体中含量增加，表明其在真菌防治中发挥了作用。与非菌根原球茎相比，共生Anacamptis morio的原球茎富含植物抗毒素。与非菌根植物相比，菌根兰花中一些类黄酮、多酚、抗坏血酸和多糖也有所增加。
非靶向代谢组学旨在研究整个代谢组。因此它是分析调控植物-真菌互作潜在的数千种相关代谢物和营养的强大工具。它已用于研究豆科根瘤、内生真菌Piriformospora indica定植的根、外生菌根和丛枝菌根中的植物微生物的相互作用。
我们利用代谢组学研究了地中海兰花Serapias vomeracea和担子菌Tulasnella calospora之间的菌根关系。将共生形成的原球茎、植物和真菌的代谢产物与非共生的原球茎、单独培养的植物与真菌进行比较。我们将代谢组学、基因组学和转录组学进行结合，发现不仅共生和非共生的原球茎代谢产物有差异，而且共生真菌Tulasnella calospora的脂质含量也有差异。
论文ID
实验设计
生物材料
Tulasnella calospora是从兰花Anacamptislaxiflora的菌根中分离出来的。25℃在2%麦芽琼脂培养基(MEA)上培养20天，取3个直径为6mm的生长活跃的菌块，放入培养皿中燕麦培养基（OA）中无菌玻璃纸膜上，用于共生种子萌发。25℃培养20天后，收集游离菌丝(FLM)，在液氮中快速冷冻，-80℃保存。
Serapiasvomeracea种子的共生和非共生萌发
在培养皿中共同接种菌根真菌和兰花种子获得共生种子发芽。种子表面灭菌后，悬于无菌水中，滴在高压灭菌的OA培养基的滤纸条上。然后将一株活跃生长的T. calospora菌丝体放在培养皿的中央，将培养皿置于20°C黑暗的环境中孵育30天，获得健康的菌根原球茎。通过将菌丝块放在灭菌的玻璃纸膜上进行共生发芽，以收集生长在原球茎附近的真菌菌丝体（MYC）。小心刮取菌丝体来收获MYC样品。在20°C的黑暗环境中，将表面灭菌的种子直接置于改良的BM1培养基上来获得非共生萌发的种子。为了使原球茎处于相同的发育阶段，接种30天后收集共生原球茎（SYMB），120天后收集非共生原球茎（ASYMB）。将所有样品在液氮中快速冷冻，-80°C储存。
代谢组学分析的样品制备
用组织研磨仪破坏Calospora菌丝体、S.vomeracea共生和非共生原球茎。将100 mg冷冻的粉末样品溶于1ml甲醇：异丙醇：水（1：1：1，v/v）的混合液体中，4℃下振摇萃取1小时。将溶液在4℃下以18620g离心15分钟，回收上清液。在离心蒸发器中干燥并在-80℃下保存。进行代谢组学分析之前，将干燥后的样品溶于200μl的50％乙腈的水中，并在4°C下以18620g的速度离心10分钟。
UPLC-UHR-QqToF-MS测量
超高效液相色谱（UPLC）超高分辨率（UHR）串联四极杆/飞行时间（QqToF）质谱（MS）的测量是用Ultimate3000RS和BrukerImpact II结合Apollo II进行的。色谱分离是在C18色谱柱上进行的。洗脱液A：含0.1％甲酸的水；B：乙腈与0.1％的甲酸。梯度洗脱开始时保持0.5％洗脱液B 1分钟，然后在15分钟内增加到30％洗脱液B，再增加5分钟达到80％洗脱液B。在最后3分钟内，恢复到0.5％洗脱液B的初始条件。流速为400μlmin-1，柱温保持在40°C。自动进样器温度为4°C。对于每个样品，在正电离（+）和负电离（-）模式下均进行了两次重复测试。在进行样品分析之前，根据不同样品制备的质量控制(QC)样品注入柱中进行处理。用50ml水，50ml异丙醇，1ml氢氧化钠和200μl甲酸进行质量校准。MS设置为：雾化器压力= 2bar，干燥气体流量= 10 l min-1，干燥气体温度= 220°C，毛细管电压（+）为4000V，（-）为3000V，终板偏移= 500V。在两种（±）模式下，质谱的质量范围均为50-1300 m /z。所有UPLC-UHR-QqToF-MS原始数据均已存储在开放式科学框架数据存储库中，并可通过以下网址访问：https：//osf.io/5ayw7/view_only=b315f2bf8fa9473cbe05417dd505ac33
非靶向代谢组学分析
每个质谱图文件分别导入到MS软件中，以进行峰选择和比对。光谱的预处理步骤是：i）降低化学噪声，ii）保留时间对准，iii）利用累加峰值检测m/z特征，iv）在同位素聚类中不使用在10%的质谱中不存在的峰，v）舍弃单例（只有一个成员的簇）。输出生成的峰矩阵，将两种（±）模式组合，并计算两次重复的平均峰强度，并将其进一步用于统计和注释分析。峰强度在0至4.6×106之间。一个样本组中，4个生物重复中少于3个为正值，而在其他组中仅为零的质量特征(m.f.)被从数据矩阵中删除。最后，为保持m.f，将零值设置为1。所得峰列表进一步用于注释和统计分析。使用网站MassTRIX3（http://masstrix3.helmholtzmuenchen.de/masstrix3）进行代谢注释。
通路和功能分析
使用BioCyc(https://biocyc.org/)的PathwayOmics Dashboard工具对通路进行分析，注释代谢物在MYC/FLM中浓度变化显著的代谢产物。使用MetaCyc v23.1(https://MetaCyc.org)作为参考数据库。MYC/FLM中被调控注释代谢物的生物学功能由KEGG、HMDB和脂质图谱数据库获得。
转录组数据
代谢组学研究中使用的共生和非共生生长条件，与之前Fochi等人的转录组学研究的条件相同。但是，MYC样本缺少转录组数据。完整的真菌和植物转录本系列可在GEO处获得（GSE86968和GSE87120）。
统计分析
四个独立的生物学重复进行实验。使用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘回归（OPLSR）法对代谢组学数据进行分析。根据先前描述的Benjamini-Hochberg程序，设定5％的假阳性（FDR），通过t-检验测试不同菌丝体（MYC和FLM）与原球茎（SYMB和ASYMB）之间有无明显差异。使用3.6.0版的R中的phyper函数进行超几何测试。
实验结果
1. 共生对植物和真菌代谢体的影响
将在共生原球茎(SYMB)和共生原球茎附近收集的T. calospora菌丝(MYC)(图1a-b，表1)与非共生原球茎(ASYMB)和在培养基上自由生长菌丝(FLM)的代谢组进行比较(图1c-d；表1)。我们发现了24818个代谢相关的质量特征(m.f.)，其中植物代谢组比真菌代谢组更复杂。
共生和非共生植物和菌丝样品中常见和特异性质量特征（m.f.）的数量在通过图2的韦恩图展示。有521个质量特征在所有样品中都存在，它们被认为是核心代谢组，可能和共生双方的初级代谢产物有关。在SYMB和ASYMB样品中有8583个质量特征重叠，而MYC或FLM样品中没有。这些重叠的质量特征可能是兰花原球茎的一般功能所涉及的代谢产物。共生或非共生兰花原球茎具有几个独特的质量特征。在MYC、SYMB和FLM样品中发现的唯一质量特征（315）可能与某些真菌特异性化合物有关，因为在ASYMB样品中未发现这些特征。相反，MYC、SYMB、ASYMB共有的一些质量特征（449）可能与从兰花转移到真菌的植物特异性化合物有关。共生原球茎（SYMB）中发现的独特3977个质量特征中，有些可能与菌根的共生特异性代谢产物有关。有趣的是，在MYC样品中独特地发现了相对大量的质量特征（1265），这表明不同的代谢物在寄主植物外部的菌丝中积累。值得注意的是，在MYC-SYMB和FLM-MYC-SYMB中发现的291和315独特的质量特征都无法在数据库中进行合理匹配。它们可能分别代表共生特异性化合物和组成型真菌化合物。
除了独特和共有的植物和真菌代谢物外，共生植物-真菌相互作用还可能导致更广泛的代谢物差异积累。所有质量特征丰度的PCA可视化了代谢物水平的变化，显示了样本之间高度不同的代谢剖面图(图3)。从第一个组件（PC1）可以看出，最明显的距离（46％）在ASYMB、SYMB和真菌菌丝体（MYC/FLM）之间。PC2（34％）清楚地将SYMB与ASYMB样本分开，而PC3（7％）则将FLC样本MYC分开。在此，通过不同的生长培养基将ASYMB与其余样品分离。
为了深入了解共生中改变的代谢物和代谢途径，我们进行了OPLSR分析，然后对显著性搞得质量特征进行了数据库注释。我们推定了质量特征，并计算了SYMB/ASYMB，SYMB/MYC，SYMB/FLM和MYC/FLM以评估代谢调节（表S1）。另外，我们采用了最近开发的MSCC方法，根据元素组成对脂质、蛋白质、氨基糖、碳水化合物、核苷酸和氧芳香族化合物中分子的总和进行分类。这种方法避免了实际数据库覆盖范围的限制，尤其是对于描述较少的生物。在MSCC图和van Krevelen图中可以看到，在植物-真菌共生过程中，注释和非注释代谢物中主要化合物的总体代谢变化显著且有差异（图4）。与FLM样品相比，MSCC分析突出了MYC中更高数量的脂质增加。这种MYC的增加也可以在van Krevelen图中看到。相反，在MYC/FLM的对比中，氨基糖和蛋白质相关化合物下降。
图1 （a）兰花种子与菌根真菌Tulasnella calospora的体外共生萌发的示意图（改编自Ercole等人（2015b）。（b）培养皿中的共生种子发芽；共同温育30天后，S.vomeracea的菌根共生原球茎（SYMB）（红色框）和真菌菌丝体（MYC）在共生原球茎附近的玻璃纸膜上生长（蓝框）。（c）播种后120天在BM1培养基上生长的非共生原球茎（ASYMB）。（d）在接种后20天（dpi）在燕麦培养基（OA）上的玻璃纸膜上生长的Tulasnella calospora的自由菌丝体（FLM）。
图2 共生（SYMB）和非共生（ASYMB）的Serapias vomeracea原球茎、自由生活的Tulasnella calospora菌丝体（FLM）和在共生在原球茎附近生长的菌丝体发生和重叠的特定和共享质量特征（m.f.）的维恩图
图3 非靶向代谢组学检测到的所有质量特征的主成分分析（PCA）得分图
（a）主成分1（PC1）与主成分2(PC2)的关系图显示了以自由生长菌丝体（FLM）和在共生原球茎（MYC）附近的收集的菌丝体之间的代谢距离，以及Serapias vomeracea共生（YMB）和非共生（SYMB）原球茎之间的代谢距离。（b）PC3描述了MYC和FLM之间的代谢差异。每个PC的方差在括号中给出。椭圆表示Hotelling的T2置信区间为95％。N＝4代表4个生物学独立的重复。FLM，红色圆圈；MYC，黑色圆圈；ASYMB，绿色方块；SYMB，灰色方块。
图4 （a-b）累积显着差异的质量特征的化合物分类图，Van Krevelen图（c-d）显示了在非共生和共生条件下所有的代谢物（灰色）和增加（红色）或减少（蓝色）的代谢物。MYC：真菌菌丝生长在菌根的原球茎附近；FLM：非共生自由生菌丝体；SYMB：共生兰花原球茎；ASYMB：非共生兰花原球茎。（c-d）中的矩形表示脂质（绿色），氨基糖（黑色）和碳水化合物（红色）。
表1 非靶向代谢组学的实验生长条件。OA：燕麦琼脂培养基
2. T.calospora菌丝体的代谢变化
在外部菌丝中清楚地检测到由共生引起T.calospora的代谢变化（图4a）。我们首先使用MetaCyc的Pathway Omics Dashboard工具进行无偏分析。将真菌与植物共生期间以及在真菌中观察到与脂质相关代谢变化可视化。MYC代谢组的脂质物质的代谢水平比FLM高的多，其次是细胞结构，激素，碳水化合物和代谢调节化合物（图5）。
由于MetaCyc无法对70％左右的代谢物进行分类，因此我们使用文献和现有数据库中的数据进一步研究了受限制代谢物的化学分类和功能。这项深入的分析表明，MYC中增加了几种与细胞结构和信号传导有关的化合物（图6，表S1）。在T.calospora外部菌丝体中观察到几种含N、O和S的化合物的显着变化（图6a）。在功能方面，与FLM相比，共生导致MYC中结构、信号和能量相关化合物的总量增加；而FLM主要与脂质有关（图5-6b，表S1）。在脂质中（120种代谢产物）中，MYC中甘油三酯（GP）（68）、肪酰基（FA）（14）和类异戊二烯（戊烯醇脂质）（13）显着增加或在FLM中未检出（表S1）。在449个与MYC-symb-asymb相同，且在MYC/FLM中有显著差异的质量特征的少数代谢物中，有32个是脂质，其中15个是甘油脂质(GL)和10个异戊二烯类。在防御中，一些参与防御的含氮有机化合物（29），有机硫化合物（8）和含氧芳香族代谢物（14）也大大增加。另一方面，少量脂质（48）（FA，10；类异戊二烯，9），很多的含N化合物（41）、有机硫化合物（17），以及植物化学化合物（17）中的生物碱（14）显着下降（图6）。
图5 与FLM相比，MYC样品代谢中产生的明显不同化合物的累积变化
纵坐标显示的每个点对应于单个代谢物的MYC / FLM的log2变化比。横坐标显示的大点是该代谢物类别中所有代谢物的平均值。MYC：真菌菌丝生长在菌根的原球茎附近；FLM：非共生自由菌丝体。功能类基于MetaCyc途径本体和使用Omics仪表板构建的图形
图6 Tulasnellacalospora菌丝体中代谢产物的变化
与FLM相比，MYC样品中代谢物的数量根据其（a）化学分类法和（b）代谢物增加（红色）和减少（蓝色）的生物学功能分组。分类基于KEGG，HMDB和Lipid Maps数据库。未知有机化合物根据其原子组成的以下优先级进行分类：S>P>N> O。对于多功能代谢物，将功能添加到不同的组中。
3. T. calospora的外部菌丝体脂质含量的特定变化
MYC和FLM之间最大的代谢组学差异在于脂质的数量和组成(图6)，特别是甘油磷脂(GP)和鞘磷脂(SP)。大部分代谢物在FLM中未检测到。在MYC增加的81个甘油磷脂(GP)中，增加最多的是溶血磷脂酰乙醇胺(lysophosphatidylethanolamine，LysoPE)，一种参与信号转导的溶血磷脂(LyP)。值得注意的是，18种甘油磷酸酯(GPS)显著增加，而只有一种甘油磷酸酯减少，甘油磷脂(GP)前体棕榈酸的丰度持续增加(log2=9.1)。关于甘油磷脂(GP)，MYC组13个磷脂酰胆碱(PC)和9个磷脂酰肌肽(PI)含量较FLM组高。此外，在MYC样本中，1-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(LPC(16:0))也增加。作为三酰基甘油和甘油磷脂（GP）生物合成的必要中间体，甘油磷脂酸PA(22:0/14:1(9Z))在MYC中也增加，因此参与能量(储存和来源)和结构代谢。MYC中大量增加的还有羟基二十酸15-HETE和8-羟基十八酸-9z,12z-二烯酸(8-hode或laetisaric acid)的衍生物，后者具有化感化学作用。此外，鞘氨醇和PICer(d20:0/16:0) 的大量积累表明MYC中鞘磷脂(SP)生物合成增加。
但是，无法进行代谢组学和转录组学数据的直接整合，因为以前的转录组学分析并未调查MYC情况。然而，在SYMB和FLM之间观察到参与脂质代谢的真菌基因表达的显着变化。在共生中上调最大的真菌基因中，有两个独立于Ca2+的磷脂酶A2和一个肌醇-1-磷酸合酶。这对于生物合成含磷脂和某些SP信号分子的肌醇至关重要。共生系统，真菌上调了磷酸肌醇激酶和三个鞘氨醇N-酰基转移酶的活性（一种参与SP生物合成的关键酶）；相反，葡糖基神经酰胺酶的活性有所降低。酰基辅酶A辅酶参与FA代谢的几个基因的表达量也受到影响，包括下调两个编码硫醇的基因。
我们在MYC/FLM比较中观察到29种类异戊二烯的变化很大，其中10种在MYC-SYMB-ASYMB中发现，但在FLM中未发现。例如八种三萜、一种二萜和一种四萜的含量增加很多。尽管无法获得有关MYC条件的转录信息，但共生原球茎中的五个编码类萜合酶的拟孢菌基因显着上调，其中两个FC>20
4. 含氮的真菌化合物
与FLM组相比，非磷脂含氮化合物是Tulasnella calospora中受到显着影响的第二大类代谢产物。MYC组中非磷脂含氮化合物的含量大大降低。尽管这些化合物无法可靠地注释，但在共生过程中真菌的氮代谢发生了强烈变化。与FLM组相比，在MYC中升高的两个化合物是UDP-N-乙酰基-D-氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc）和二烷基-N-乙酰基-α-D-氨基葡萄糖磷酸。含N化合物是合成肽聚糖、基磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白、SP和糖脂不可缺少的成分。UDP-GlcNAc聚合形成几丁质，几丁质是真菌细胞壁的主要成分。与MYC和FLM相比，其去乙酰化形式的几丁质和壳聚糖短齐聚物在SYMB中富集程度相似(log2从11.9到13.6)，而MYC和FLM之间没有差异。壳聚糖是通过几丁质去乙酰化酶活性产生的。T. calospora的基因组又9个基因几丁质去乙酰化酶。相对于FLM， SYMB组中有3个基因显著上调。相反，在共生条件下，单个几丁质合酶略有上调。几丁质低聚物可以通过几丁质酶分解几丁质高聚物产生。共生改变了真菌和植物几丁质酶的表达，某些植物几丁质酶在共生原球茎中强烈上调。
比较共生和非共生组，另一类主要受调控的是参与氨基酸（AA）代谢的含氮化合物。与其他样品相比，SYMB中发现了N-精氨酸琥珀酸酯的积累。该化合物参与精氨酸的合成和延胡索酸酯的形成，这是TCA循环的重要中间体。共生组织（SYMB）的代谢组学研究并不容易，因为它们既包含植物代谢物又包含真菌代谢物，所以不能确定它们在共生体的分配。因此，除少数例外，大多数氨基酸和氨基酸衍生物无法确定是真菌还是植物的。仅在SYMB中才能检测到麦角硫氨酸，它是一种天然存在的组氨酸代谢产物，仅在某些真菌和细菌中发现。相比之下，SYMB/MYC中的另一种真菌特异性与组氨酸相关的化合物海西因的水平较低。转录组学证据表明，共生状态下T. calospora在组氨酸合成中有重要作用，SYMB样品中的三个组氨酸合成基因显着上调。
5. 含硫有机化合物
与FLM组相比，MYC组中T. calospora中含硫化合物有明显变化。有14种含硫化合物增加，18个减少。与含氮化合物相似，许多有机硫化合物无法准确地注释。S-腺苷甲硫氨酸胺是一种例外，它参与多胺的生物合成，是腺苷甲硫氨酸（SAM）的脱羧衍生物。值得注意的是，与FLM相比，MYC中S-腺苷甲硫氨酸的含量大大减少，而SAM的含量却增加了。SAM是涉及甲基化反应的甲基的主要来源。SAM在MYC组中大量积累说明它在共生中发挥作用。尽管SAM的水平在SYMB/MYC或SYMB / FLM中没有显着差异，但转录组学研究表明，共生状态的T. calospora的SAM合成酶基因上调。代谢组学数据进一步表明，与ASYMB相比，SYMB中的SAM含量显着降低，这表明在共生状态下植物的SAM含量降低。
讨论
转录组学是间接研究共生生物代谢变化的最常用方法。它通过基因表达的变化揭示了双方的贡献。此方法已成功用于植物和真菌分子混合且无法分离的兰花原球茎，但是，编码酶基因的转录不能反映最终的酶活性，这质疑了代谢物和转录本之间的直接联系。因此，我们使用非靶向方法直接研究兰花的代谢变化，并使用转录组数据来验证代谢组学结果。主要发现总结于图7。
获得相似发育程度的SYMB和ASYMB原球茎需要不同的生长条件和培养基，这阻碍了植物代谢组的比较。但ASYMB组原球茎的代谢产物可以评估植物或真菌的代谢产物在共生中的作用。将MYC与FLM组的菌丝体进行比较，可以得到很有趣的结果。虽然我们不能排除生长条件对共生和非共生菌丝体代谢产物的影响，但MYC中代谢物产物的变化主要是由原球茎影响的。之前的研究表明，共生作用是真菌转录组变化的主要决定因素，远大于环境生长条件。在兰花菌根共生系统中，原球茎所需的所有有机营养物都被是由真菌提供的。因此，不能排除某些植物来源的有机化合物可能是从共生真菌中转移到植物的。MYC中鉴定的大多数代谢物也可能是由T. calospora产生并在植物积累的。在MYC、ASYMB和SYMB共有的质量特征（449质量特征）或MYC和SYMB共有的质量特征（219质量特征）中找到此类植物化合物。但由于缺乏MYC条件下的转录组数据，我们无法确定这些化合物是来源于植物还是真菌。
图7 与自由生活的Tulasnellacalospora菌丝体（FLM）相比，共生原球茎（SYMB）以及原球茎周围和与之接触的菌丝体中真菌代谢变化的示意图
缩写：FA：脂肪酰基，GL：甘油脂，GP：甘油磷脂；GPS：甘油磷酸丝氨酸；PC：磷脂酰胆碱；PI：磷酸肌醇；PR：prenol脂质（类异戊二烯类）；SP：鞘脂；SAM：腺苷甲硫氨酸。
1. 共生使T.calospora的脂质含量发生深刻变化
脂质是FLM和MYC组中累积差异最大的代谢产物。除了是细胞膜的主要结构成分外，脂质还提供重要的生物学功能，例如在信号传递，胁迫反应和植物-微生物相互作用中的能量和碳存储。由于在共生的丛枝菌根真菌的菌丝中发现了大量的脂质，脂质已成为菌根研究的重要课题。T. calospora基因组有用于脂质生物合成的基因，尽管我们无法排除植物中的某些脂质转移，但T.calospora菌丝中脂质含量的增加更可能是其自身生物合成。
磷脂和鞘脂是细胞膜的重要组成部分，它们在信号传导，细胞骨架重排和膜运输中起着关键作用。在真菌中，鞘脂对于菌丝形成、细胞生长的调节和分化以及细胞分裂有着很重要的作用。此外，脂质的衍生物对于细胞内、外信号转导和防御有害微生物的增殖至关重要。
在MYC组中增加最多的脂质是甘油磷脂，尤其是磷脂酰丝氨酸。鞘氨醇和PI-Ce是鞘脂的前体，鞘脂也是真菌细胞膜的重要组成部分。这些化合物和其他9种磷酸肌醇在MYC中显着增加，这可能反映了磷酸肌醇磷酸酶和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（鞘氨醇和甘油磷酸肌醇的生物合成所涉及的关键酶）共生的上调。
我们在MYC中也观察到参与信号传导和防御的脂质大量增加。溶血磷脂是植物中必需的信号分子和生长调节剂。脂肪酸8-HODE（或来苏地酸）源自亚油酸，是一种生物活性的脂蛋白，在植物和真菌互作中充当信号。8-HODE首先是在担子菌Laetisaria arvalis中发现，是一种抑制植物病原性真菌生长的化感物质。15-HETE是一种用于羟基合成生物素的羟基化脂肪酸底物。8-HODE和15-HETE在MYC大量增加，表明MYC中的信号转导装置在共生过程中具有很高的活性。有趣的是，在膜稳态，信号转导和毒力中起作用的一些独立于Ca2 +的磷脂酶A2是T.calospora基因中最上调的基因。尽管外部菌丝中结构膜脂质数量的增加可能仅反映了菌丝生长以及共生后膜发生的需求，但潜在的膜信号分子的增加却令人着迷。
2. T. calospora菌丝体中含有N和S的有机化合物
更难解释的是MYC样品中大量的含N和S的化合物减少了（图4、6）。我们认为，真菌为宿主提供了有机氮。这可以由菌根原球茎细胞中某些植物氨基酸转运蛋白的剧烈上调证明。因此，我们可以推测，MYC中某些含氮化合物的减少可能是转移至宿主的结果。
关于硫，目前尚无有关将其转移到兰花菌根的植物的信息。在少数准确鉴定的含S化合物中，MYC的SAM升高。SAM是DNA、RNA、蛋白质代谢物或磷脂甲基化的主要甲基供体。鉴于使用SAM作为甲基供体的甲基转移酶的靶标底物种类繁多，目前还不能在T. calospora中鉴定此类靶标。
另一个值得注意的含S和N的化合物是麦角硫氨酸，该氨基酸主要存在于真菌中，在植物中未检出。与MYC或FLM相比，该化合物被高度诱导。麦角硫氨酸有强大的抗氧化性能力。它在SYMB中的积累表明T. calospora处于氧化环境，并以抗氧化剂的积累作为应对。
3. 几丁质和几丁质相关代谢产物
几丁质是真菌细胞壁的主要结构成分，也是调节植物与微生物相互作用的信号分子的来源。几丁质特异性的植物识别受体是聚合度为6至8的壳寡糖。但是，SYMB组中原球茎中积累的几丁质聚合物要小得多，聚合度为2和3（壳二糖和壳三糖）。几丁质寡聚物可能是通过生物合成的，也可以通过真菌和植物几丁质酶从更长的几丁质聚合物中裂解产生几丁质低聚物。大多数植物几丁质酶是几丁质内切酶，它们在几丁质聚合物的内部位点随机裂解。植物几丁质酶通过水解真菌病原体的细胞壁几丁质，释放出几丁质寡聚体，从而触发植物防御反应。尽管我们没有直接证据表明SYMB原球茎中壳二糖和壳三糖的起源，但转录组数据表明它们是由植物几丁质酶的活性产生的。在SYMB组中，T. calospora中两个表达几丁质合酶的基因只有一个稍微上调。相反，在SYMB中强烈诱导了GH18和GH19家族的植物几丁质裂解酶。这与以前的研究结果一致。在丛枝菌根中，属于GH18家族的植物几丁质酶在细胞中的强烈表达，会减少共生真菌壁释放的几丁质的数量。
壳聚糖是几丁质的脱乙酰基形式，在担子菌的细胞壁中很少见。因此，在SYMB原球茎中发现类似的甲壳质和壳聚糖低聚物富集现象很有趣。壳聚糖是通过几丁质脱乙酰酶的脱乙酰产生的。SYMB原球茎中三个T. calospora几丁质脱乙酰酶基因的上调表明。据报道这是内生真菌和土壤传播病原体防止几丁质触发的植物免疫的一种策略。几丁质脱乙酰酶在外生菌根菌和丛枝菌根菌与植物的相互作用中也受到调节，表明其在共生关系的建立和运行中发挥着作用。
4.代谢组学研究的当前挑战
利用代谢组学，我们展示了兰花菌根中代谢的重排，以及可能与结构、信号传导、防御和营养功能相关的化合物的变化。但是，我们的方法也有一些局限性。与特定的基因组、转录组分析相反，不同生物中通常存在相同的代谢产物，这妨碍了混合共生样品的分析。另外，由于兰花种子需要不同的培养基才能非对称地萌发并形成原球茎，因此很难对SYMB和ASYMB进行直接比较，因为某些代谢变化可能源自不同的培养基。但是，可以有效地证实真菌MYC/FLM中看到的变化。
另一个限制是几个无法注释质量特征，这是一个可能包含关键信息的“暗物质”。总体而言，在非靶向代谢组学研究中，代谢物注释仍然存在严重局限性：目前仅在数据库中发现约2％的光谱，比达到80％的基因组注释少得多。此外，代谢组学报告通常关注模型生物，妨碍了对非模型生物的分析，例如T. calospora和S. vomeracea，它们与数据库中发现的生物在进化上相距甚远。对于兰花则富含未知的次生代谢产物。尽管我们使用MetaCyc，这是来自生活所有领域的最大代谢途径的数据库，但在比较MYC/FLM时，仍无法鉴定451种代谢物，这限制了我们生化途径的重建。但是，我们可以估计检测到的质量特征的元素公式。使用超高质量分辨率并遵循“七个黄金法则”，我们可以准确地测量代谢组指纹图谱的质荷比，并极有可能对代谢物元素公式进行估算。因此，我们能够对许多质量特征进行分类，并克服了实际数据库的限制。
总之，我们揭示了代谢物特征的深刻变化，主要是围绕共生原球茎的兰花菌根外生菌丝体中脂质代谢的急剧调节。尽管需要进一步和更敏感的有针对性的分析来阐明在共生中观察到的代谢变化的重要性，但我们的研究提供了对兰花-真菌相互作用基础的代谢网络的更全面的了解。