基于质谱和纳米技术的结核生物标志物血清检测方法——实现幼儿结核的快速、早期诊断和疗效监测

结核是由结核分枝杆菌（Mtb）引起的严重危害人类健康的重大传染病，是全球十大死亡原因之一[1]。自2015年始，为降低结核发病率和死亡率，世界卫生组织（WHO）和联合国制定了“终止全球结核病流行”的战略目标（2030年和2035年）和里程碑目标（2020年和2025年）[2]。2020年WHO报告显示，全球每年仍有1000万结核新发病例，而病死率高达15%，尽管全球结核病防控取得一定进步，但远未达到2020年里程碑目标（相对2015年，结核病发病率减少20%，死亡病例减少35%）[1]。全球范围内仍有近三分之一结核病例未被诊断或报道，漏诊或漏报现象在难诊结核（儿童结核、肺外结核和HIV-TB共感染者）人群中尤为严重[1]。

全球每年有100万儿童结核病，其中约239,000病例死于结核相关因素[1]。约80%的儿童死亡病例为5岁以下幼儿，96％幼儿结核是由于未接受抗结核治疗而死亡[3]。幼儿结核病诊断困难、容易漏诊可能是其治疗不足的主要原因。幼儿结核临床症状非特异，易与其他儿科呼吸道疾病混淆，通常不被优先考虑。在缺乏治疗情况下，幼儿结核容易发展为播散性或肺外结核病，导致结核诊断难度增加[4-7]。5岁以下幼儿，尤其是HIV-TB共感染幼儿，通常难以获得合格呼吸道样本，而替代标本如诱导痰和胃液等均具有一定侵袭性，幼儿依从性不佳。此外，幼儿结核通常为少菌型结核（感染菌量较少情况下仍可发展为结核病），即使获得痰液样本，基于痰液的传统方法检测敏感性不佳，导致幼儿结核病诊断具有极大挑战性[4,8,9]。

临床诊断方法中，培养方法是结核诊断金标准，但其耗时长，在幼儿结核中敏感性为30-62%[9,10]。分子诊断方法（如Xpert RIF/MTB和 Xpert Ultra）能快速诊断结核，但在幼儿结核中阳性率仅为培养方法的62-66% [11-15]。免疫相关性检测（如TST和γ-干扰素释放试验）不能区分活动性与潜伏性结核，且在免疫低下或免疫系统发育未全幼儿中敏感性低[16,17]。因此，在容易采集的临床样本（如血液、尿液）中直接检测Mtb衍生因子，有望成为诊断结核病的新途径。但这些因子在血液或尿液中含量过低，或可能存在与宿主蛋白相互作用，通常检测困难。脂肪阿拉伯甘露聚糖（LAM）是Mtb细胞孔的主要组成部分，是直接测定法中最常用的靶标，但LAM试验对活动性幼儿结核诊断敏感性不佳[19-21]。

迫切需要开发不依赖痰液标本且更加有效的新检测方法来改善幼儿结核病诊断。近年来，随着质谱技术快速发展，一种应用MALDI-TOF直接测定结核血清生物标志物（CFP-10抗原肽）的检测方法被提出，并首次用于活动性结核诊断 [18,22-23]。该检测以血液样本中CFP-10经蛋白酶消化后所产生的Mtb特异性肽段作为抗原检测的靶标，可避免宿主蛋白遮蔽作用以及NTM干扰，相较ELISA等CFP-10检测方法具有更高特异性。纳米盘材料的吸附特性以及与MALDI-TOF的信号协同作用增加了检测灵敏度。特异性抗体以及同位素标记内标的使用，增加了检测准确性。具有不依赖痰液标本、能快速检测、具有高敏感性和高特异性的特性。据报道，该血清CFP-10检测技术对培养阳性的HIV感染（91%）成人结核和HIV未感染（93%）成人结核敏感性均较高，相对健康人群亦具有较高特异性（87-100%）[22]，提示基于MALDI-TOF的血清CFP-10检测可应用于肺结核的快速诊断。血清CFP-10检测仅需少量血液样本（100µL血清）即可进行定量分析，可有效克服幼儿结核的取样困难，但其在幼儿结核的诊断潜能未知，缺乏大型临床研究进行验证。

在BMC Medicine上美国杜兰大学胡晔教授团队最近发表的一项大型HIV暴露幼儿4年随访队列研究，回答了这一悬而未决的问题[24]。对519例HIV暴露幼儿（HIV感染284例，HIV未感染235例）的660份血清样本应用MALDI-TOF-MS和纳米盘进行CFP-10定量检测后发现：HIV感染幼儿中，基于MALDI-TOF的血清CFP-10检测对确诊结核敏感性为100%（5/5，95％置信区间[CI]，47.8-100%），对临床诊断结核敏感性为83.7%（36/43，95%CI，69.3-93.2%），特异性为93.1％（203/218，88.9-96.1%）。HIV未感染幼儿中，基于MALDI-TOF的CFP-10检测可检出全部确诊结核（1例），以及75.0%的临床诊断结核（15/20，95%CI，50.9-91.3%），特异性为96.2％（177/184，95%CI，92.3-98.5%）。其对幼儿结核的诊断敏感性高于WHO推荐的高于66%的敏感性标准（WHO建议不依赖痰液的生物标志物类新型检测方法，在儿童结核中敏感性应至少与Xpert MTB/RIF诊断水平相当，诊断微生物学确证[培养阳性]肺结核病例敏感性需≥66％[25]），特异性接近WHO推荐的98％特异性阈值。值得注意的是，与大多数结核病诊断方法不同，血清CFP-10检测敏感性在HIV感染和HIV未感染幼儿结核中并未发现显著差异。与之前研究一致，HIV感染结核病例的血清CFP-10浓度比HIV未感染幼儿浓度更高[18,22]。研究推测，尽管HIV感染幼儿结核通常为少菌型结核，感染初期结核菌量较少，但Mtb进入机体后会释放大量蛋白毒力因子（CFP-10等），刺激机体产生特异性免疫应答。但免疫缺陷情况下，机体对Mtb感染的抵抗力减弱，Mtb分泌的CFP-10毒力因子增多，致使这些HIV感染幼儿血液中可能具有更高丰度的CFP-10信号。

大多数年龄低于5岁的幼儿结核因临床症状不特异、菌量少、基于痰液的检测方法诊断受限，在疾病早期并不能得到准确诊断，导致抗结核治疗启动延迟。尤其是HIV-TB共感染幼儿和患有结核性脑膜炎的病例，在缺乏治疗干预情况下，疾病迅速发展，可能导致幼儿出现不可逆损伤甚至死亡[3]。胡晔等发现在此项幼儿队列研究中，早在结核病诊断前60周即可检测到CFP-10阳性信号，CFP-10检测阳性率在靠近结核诊断点附近时逐渐增加，在结核诊断前24周，幼儿结核CFP-10诊断敏感性达76.5％。考虑到<5岁幼儿人群结核感染与结核病间隔时间较短， CFP-10检测可能作为<5岁幼儿人群早期结核病诊断的筛查方法，为临床对幼儿进行预防性抗结核治疗提供支持证据。

当前的结核治疗指南要求结核病患者应接受6到9个月的抗结核药物治疗，但患者治疗效果与个体所需实际治疗时间可能与年龄、免疫功能、感染部位和耐药性相关[26]。过度的抗结核治疗可能会增加幼儿不良反应以及不必要的经济负担，而治疗不足则可促进结核病复发，甚至增加结核菌耐药性。需要快速且即时的疗效监测手段以解决这些问题，但是当前的结核病检测方法缺乏速度、敏感性或特异性，而Xpert MTB/RIF无法区分活菌和死菌，不适用于结核治疗监测[27]。胡晔等发现，在开始抗结核治疗后，CFP-10检测阳性率逐渐降低。抗结核治疗有效的幼儿结核，CFP-10浓度随治疗时间增加而逐渐下降，结核治愈后，CFP-10亦降为0，这提示了基于血液检测的CFP-10可能作为结核疗效监测的直接生物标志物。<5岁幼儿和肺外结核病例很少有痰液标本可用于结核病诊断，且受取材限制通常不允许多次取样以用于结核疗效监测，本研究CFP-10检测相关发现有望改善这些人群的疗效监测现状。

然而，该项研究仍然存在一些局限性。由于培养方法的局限性，该研究中的幼儿结核多为临床诊断结核病（92.3％），而不是经微生物学证实的确诊结核病例。该研究未直接将血清CFP-10检测方法与目前的分子诊断方法（Xpert MTB/RIF或Xpert Ultra等）直接进行比较。大多数幼儿在预期的随访中并没有收集到可用于评估CFP-10检测的血清样本。最后，质谱仪器和纳米盘材料要求可能会限制其在临床的应用推广，特别是在资源有限的环境中。

尽管如此，但该研究结果表明，血清CFP-10靶蛋白信号可以改善儿童结核病诊断，因为它超过了WHO规定的新的非痰诊断的敏感性要求，并且在所有结核病表现上表现相似，包括通常难以诊断的培养阴性结核和HIV/TB合并感染人群。值得注意的是，血清CFP-10分析可能对早期结核病病例的诊断和结核病治疗监测具有实用价值。为了进一步验证这些发现，仍需设计新的研究队列，在特征明确的患者群体中使用连续血清来进行结核生物标志物分析。然而，我们仍然认为，CFP-10靶蛋白检测对未被发现以及不能通过现有实验室检测准确诊断的结核病病例，直接预测、诊断和评估监测治疗反应的能力，对临床医生具有巨大的潜在价值。期待这一创新技术早日实现临床转化，并广泛应用，助力2030年终结全球结核病流行，实现联合国抵御结核的可持续发展目标。

原文链接：https://www.readcube.com/articles/10.1186/s12916-021-01983-w

撰文：毛莉妍 （华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科）

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