【LorMe周刊】Pulcherrimin的形成控制枯草芽孢杆菌生物膜的生长停滞
作者：曹可豪，南京农业大学硕士在读，主要研究高产铁载体抗病和促生功能菌株的筛选。
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导读
在实验室中，枯草芽孢杆菌生物膜的形成过程始于“初始”细胞的分化。这些分化出的细胞亚群转录生物膜基质合成所需的操纵子。随着时间的变化，初始分化的细胞群落和细胞外基质里的相关操纵子控制生物膜的扩张。但是，经过2天或3天的时间后，生物膜的扩张停止了。研究将细胞外铁载体pulcherriminic的产生与生物膜扩张的停止联系起来分析，发现pulcherriminic可以通过耗尽培养基中的铁来操纵生物膜的微环境。
枯草芽孢杆菌NCIB3610成熟生物膜的大小是有限的（图1A），其中群落所占的生物膜面积大小与所提供的营养物质的面积大小无关(图1B)。解释生物膜生长停滞的一个简单假设是，生物膜中的所有细胞在72h(生物膜停止快速扩张的时间点(图1A))之前都已经形成了芽孢，这将导致生物膜中的细胞代谢停止。然而，研究发现，尽管野生型生物膜中的耐热芽孢数量随着时间的推移逐渐增加，但即使在120h时，芽孢的百分比也没有达到整个生物膜中细胞总数的100%(图1C)。研究得出结论，在野生型菌株培养120h后细胞膜中的细胞群仍然保持代谢活性，因此生物膜的扩张必然受到其他一些过程的限制。
图1 生长停滞是生物膜形成的独特阶段
（A）随时间测量NCIB3610生物膜占据的面积（B）在具有不同直径的琼脂平板上生长120h后，测量NCIB3610生物膜的面积。（C）在所示的时间点测量由NCIB3610形成的耐热孢子的数量
在基因yvmC和cypX控制下两个tRNA-亮氨酸分子转化为pulcherriminic，在非酶反应中，pulcherriminic从细胞中分泌出来，pulcherrimin是Fe3+与pulcherriminic结合形成的的螯合物（图2A）。yvmC和cypX与转录调节子（PchR）和假定的膜结合转运蛋白yvmA的编码区共定位在基因组上（图2B）。通过将亲本NCIB3610菌株的yvmC和cypX基因敲除，研究证实其不再产生棕色色素（pulcherrimin）（图2C）。研究继续检查yvmC和cypX缺失是否影响生物膜的形成。在生长的最初48h内，野生型和缺失突变型生物膜的表型在总体结构（图2D）和疏水性（图2E）方面几乎没有区别。相反，在稍后的时间点，NCIB3610生物膜所占面积停止增加（图2F和H）。由yvmC和cypX缺失菌株形成的生物膜会随着时间的推移而继续扩大，几乎占据了所提供的整个培养基。
图2 Pulcherrimin的生产限制了生物膜的扩张
（A）示意图描绘了在Pulcherrimin的形成所涉及的步骤。（B）pulcherriminic生物合成簇的基因组组织（C）在MSgg琼脂上在37°C下生长24h后，NCIB3610和cypX（NRS5532）和yvmC（NRS5533）缺失菌株。（D）由C中详细描述的菌株形成的生物膜的图像。（E）在D中所示的生物膜上放置5µL水滴可显示疏水性。对于D和E生物膜在30℃下在MSgg琼脂上生长48h来自生物膜形成过程的代表性图像（F和G），显示了NCIB3610（F）和yvmC突变体（G）覆盖的区域。（H）由NCIB3610，yvmC（NRS5533），cypX（NRS5532）和yvmA（NRS6248）菌株形成的生物膜每20分钟成像一次，共检测160h。计算并绘制在直径为9厘米的培养皿上的面积
使用原位共聚焦显微镜发现在120h后，野生型生物膜前缘细胞被包含在多层结构中，而对于cypX和yvmC缺失菌株，生物膜还维持在单层的“扩张”状态。
图3 在没有产生pulcherriminic的情况下生物膜扩张
（A）对于NCIB3610和cypX（NRS5532）和yvmC（NRS5533）缺失菌株，在24和120h的生物膜边缘的共聚焦显微镜检查由（B）NCIB3610，hag（DS1677），epsA-O（NRS2450），tasA（NRS5267），bslA（NRS2097），yvmC（NRS5533），yvmChag（NRS5560），yvmCepsA-O（NRS6269），yvmCtasA（NRS6276b）和yvmCbslA菌株形成的生物膜在120h后成像。（C）计算在直径为9cm的培养皿中菌株形成的生物膜所占据的面积
将tasA，epsA-O，bslA和hag（编码鞭毛蛋白）的突变引入yvmC突变体，培养120h后epsA-O或tasA突变插入yvmC突变体完全阻断了pulcherrimin缺陷菌株生物膜的扩张（图3B和C）。但是，对于bslA突变，在不存在bslA的情况下仍可获得少量的生物膜扩张（图3B和C）hag生物膜的面积与亲代NCIB3610生物膜的面积相当（图3B和C）。相比之下，虽然与yvmC突变体相比，yvmChag生物膜覆盖的面积显着减少，但大于hag占据的面积（图3B和C）。因此，不产生pulcherrimin的菌株在培养基表面上的定殖是基于鞭毛的动力与由生物膜操作子驱动的扩张相结合的结果。
图4 数学模型揭示了铁限制与生物膜的关系
（A）生物膜生长和pulcherriminic的生产以及铁含量的数学模型（B）随时间绘制的生物膜的面积（C）模型显示了随着时间的推移生物膜的膨胀和Pulcherrimin的产生以及琼脂中剩余的游离铁含量
为了测试前面提出的“扩张波”假设，研究测试不同处理培养基中的铁含量，NCIB3610培养48h后培养基中可利用的铁含量下降到低于<1μM（图5A）。相反，即使经过72h培养，yvmC和cypX缺失菌株培养基中的铁含量仍有15至20μM。为了测试细胞是否以不同的方式对这些不同的铁含量作出反应，研究使用了PdhbA-lacZ转录报告基因（铁限制时菌株分泌蓝色物质）。对于野生型菌株，在生物膜形成的早期（培养48h）无法检测到PdhbA-lacZ转录报告基因的活性证据（图5B和C）。然而，大约72h后，即细胞膜停止扩张时间点，在生物膜的外围附近形成了深蓝色的细胞环，这表明PdhbA-lacZ转录报告基因进行了转录（图5D）。这种着色模式在随后的时间点在生物膜中得以维持和增强（图5E）。相反，对于两种不形成pulcherrimin的菌株，即使在120h后，生物膜中也几乎看不到蓝色。这些发现表明，尽管细胞生长会消耗琼脂中的铁，但由于生成了pulcherrimin，导致生物膜附近的游离铁减少至无法支持继续扩增的水平。
图5 铁消耗检测
（A）不同菌落下琼脂中有效铁的含量（B-E）野生菌株铁消耗检测（F-G）cypX、yvmC突变株铁消耗检测
通过将数学模型和显微镜与细菌遗传学结合起来，研究发现生长停滞是枯草芽孢杆菌生物膜发育的一个独特阶段，这不仅仅是芽孢形成的结果。研究确定，pulcherriminic的生产是导致生物膜生长停滞的一个重要因子。pulcherriminic主要是通过螯合Fe3+，在生物膜周围形成pulcherrimin，这是限制生物膜扩张的一个必要过程。从进化的角度分析，自我限制生长是不符合常规的，pulcherrimin的生产可能对细菌本身具有有益的影响， pulcherrimin可能延伸到生物膜的外部，从而可以阻止邻近菌群的定殖。
论文ID
原名：Pulcherrimin formation controls growth arrest of the Bacillus subtilis biofilm
译名：Pulcherrimin的形成控制枯草芽孢杆菌生物膜的生长停滞
期刊：PNAS
IF：9.580
发表时间：2019.7
通讯作者：NicolaR.Stanley-Wall
作者单位：英国邓迪大学生命科学学院分子微生物学系