科研 | Science：患有家族性腺瘤性息肉病患者的结肠生物膜中携带致癌细菌
导读
结肠直肠癌(CRC)在全球非常普遍，结肠上皮细胞突变的积聚促进正常黏膜向腺癌转化。发生在遗传突变导致CRC约占5％。遗传性家族性腺瘤息肉病(FAP)由APC肿瘤抑制基因种系突变引起。具有相同APC基因突变的家族中，息肉形成的发生和频率差异很大，表明还有其他因素导致疾病发作，包括微生物群及其组分。
结肠含有数万亿的细菌，致密的黏液层限制细菌-上皮细胞接触促进对外来抗原的耐受性，因而限制黏膜炎症反应。相反，在一些生物膜形成时，细菌破坏结肠黏液层可促进慢性黏膜炎症。
先前的研究发现，散发性CRC患者正常黏膜上的生物膜与促癌状态有关，表明生物膜形成对CRC有显著的影响。为了验证生物膜形成可能是遗传性结肠癌进展的早期因素的假设，对临床实行结肠切除术的FAP患者的黏膜进行了研究。
原名：Patients with familial adenomatous polyposis harbor colonic biofilms containing tumorigenic bacteria
译名：患有家族性腺瘤性息肉病患者的结肠生物膜中携带致瘤细菌
期刊：Science
IF：37.205
发表时间：2018年
通信作者：Cynthia L. Sears
通信作者单位：Johns Hopkins University
1、E. coli和B. fragilis是FAP胃肠道中常见的黏膜菌。
用宏细菌16S核糖体RNA(rRNA)荧光原位杂交(FISH)探针标记息肉和肉眼可见的正常组织，结果发现：每位FAP患者的结肠轴散布的黏液层中均有细菌侵入(图1A)，同时鉴定了主要的生物膜成员为E. coli和脆弱拟杆菌(图1A，底部图)。所有携带生物膜的患者均发现生物膜群落成员侵入上皮细胞层的现象(图1B)，这与散发性CRC患者的发现类似。因此，E. coli(Escherichia coli)和脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)是FAP胃肠道中常见的黏膜菌。
含有聚酮化合物合酶(pks)基因毒性岛(编码负责合成colibactin基因毒素的基因)E. coli在体外和体内诱导DNA损伤以及在氧化偶氮甲烷(AOM)处理的IL-10缺陷小鼠中诱导结肠肿瘤发生，而产肠毒素脆弱类杆菌(ETBF)诱导ApcMin/+小鼠的结肠成瘤。本研究结果发现：与健康受试者黏膜(22％pks+ E. coli和30％ETBF)相比，FAP患者黏膜的pks +E. coli(68％)和ETBF(60％)显着相关(图1C)。ETBF或pks +E. coli与FAP患者的息肉或正常黏膜没有关联。值得注意的是，考虑到单个物种的频率，pks +E. coli和ETBF黏膜协同发生率(52％)高于预期的随机发生率(40.8％)(图1C)。健康对照受试者亦是如此(实际为22％，预期为6.6％)(图1C)。PCR分析发现，FAP早期患者的黏膜生物膜包含bft和clbB，分别对应B. fragilis和E. coli的致癌亚型，存在于与FAP上皮直接接触的黏液层中(图1D)。相反，在3760名对照受试者的黏液层中未检测到毒力基因，而在3730名对照受试者的黏液层中检测到了bft，与已报道的研究结果分析一致(图1D)。
图1 FAP粘膜组织的荧光原位杂交（FISH）和微生物学培养分析。
2、ETBF和pks +E. coli共同诱发AOM小鼠肿瘤发生
使用致癌物AOM处理SPF级野生型小鼠，并且单独接种或共同接种典型的pks +E. coli菌株(NC101)和ETBF(086-5443-2-2)。粪便中ETBF或pks +E. coli的定植在单菌株接种或共同接种的条件下相似。定植15周时，单菌株接种(pks +E. coli或ETBF)小鼠几乎没有肿瘤。然而，共同接种小鼠的肿瘤明显，包括侵袭性癌症，表明肿瘤发生需要两种细菌的存在(图2 A至C)。肿瘤发生需要bft和E. coli素基因毒素的存在，因为bft基因和pks毒力岛的框内缺失显着降低了肿瘤的发生(图2A)。
ETBF和pks +E. coli共同接种的ApcMinD716/+小鼠发病率增强，体重快速减轻并且死亡率显着增加(P <0.0001)[在8周时死亡率80％(n = 8)，12周时死亡率20％ (n= 2)]。相比之下，用ETBF或pks +E. coli单株接种的小鼠，在定殖后15周的存活率分别为90％(n = 9)和100％(n = 10)(图2D)。值得注意的是，在接种早期，与ETBF或pks +E. coli单株接种相比，共同接种小鼠的炎症增加。上述结果表明，在ApcMin/+小鼠模型中，结肠炎症和早期肿瘤发生显着增加了共同接种小鼠的早期死亡率。
与肿瘤发生率一致，组织病理学分析显示，与单株接种小鼠相比，AOM处理的共同接种小鼠的结肠增生和黏膜微腺瘤显着增加(图3A)。然而，组织病理学评分显示，随时间推移(4天至15周)，单株接种和共同接种小鼠的炎症差异不显著(图3B)。因此，炎症可能不是肿瘤诱导差异的原因。为了确定炎症是否导致了肿瘤发生的差异，通过流式细胞术分析了单株接种和共同接种的野生型AOM小鼠的固有层免疫细胞浸润。结果显示，在感染的急性(1周)或慢性(3周)阶段，所有接种组中B细胞的流动显着发生变化(图3C)，但单株接种和共同接种的AOM小鼠之间的T细胞浸润(CD4，CD8或γδT细胞)和髓细胞群的比例没有显着差异(图3C)。
图 2 由pks +E. coli和ETBF共同接种增加了CRC小鼠模型的结肠肿瘤发病和死亡率。
3、IL-17在ETBF和pks +E. coli共同接种的AOM模型中的作用
已有研究表明，ApcMinD716/+小鼠中ETBF的致瘤潜力部分归因于IL-17。因为在共同接种的条件下bft协同的肿瘤诱导(图2A)，本文研究了IL-17在共同接种的AOM模型中的作用。尽管定量PCR结果显示，在15周时，ETBF单株接种和ETBF与pks +E. coli共同接种小鼠的黏膜IL-17的mRNA水平没有显着差异，但共同接种的IL-17缺陷型AOM小鼠的肿瘤发生消除(图3D)。为了特异性检测ETBF和pks +E. coli共同接种是否影响结肠黏膜IL-17的早期分泌，通过流式细胞术分析了单株接种和共同接种的无菌C57BL/6小鼠的先天性和适应性淋巴细胞亚群。与ETBF或pks +E. coli单株接种小鼠相比，共同接种的无菌小鼠黏膜中，产生IL-17的细胞增加，主要是TH17和γδT17细胞(图3E)。尽管对于肿瘤发生是必需的(图3D)，但IL-17不足以协同共同接种小鼠的肿瘤发生，因为ETBF单株接种(图S7)强有力地诱导IL-17的分泌，但是AOM小鼠结肠的肿瘤发生率很微弱(图2A)。
图 3 细菌驱动的肿瘤发生需要IL-17诱导的炎症。
4、ETBF通过降解黏液促进pks +E. coli的定植
上述结果已经提到，所有接种组的B细胞流入显著变化(图3C)，利用ELISA测定分泌型免疫球蛋白A(IgA)。共同接种小鼠对pks +E. coli的IgA应答明显比pks +E. coli单株接种的小鼠强得多，而粪便中抗-ETBF的IgA应答在单株接种和共同接种的条件下相似(图4A)。 因此，粪便IgA应答增强对共同接种小鼠中的pks +E. coli是特异性的，这表明共同接种增强了对pks +E. coli与黏膜的接触。
尽管单株接种和共同接种条件下pks +E. coli和ETBF的粪便的定殖能力相当，但共同接种条件下黏膜附着的pks +E. coli显著高于pks +E. coli单株接种(图4B)。在单株接种条件下，大部分pks +E. coli仅可从结肠肠腔内培养，但在ETBF存在下，pks +E. coli在黏膜定植水平高(103-106CFUs/g组织)。使用产Muc-2的HT29-MTX-E12体外单分子膜研究了pks +E. coli和ETBF对黏液的影响。尽管pks +E. coli对黏液厚度没有影响，但ETBF单株接种或与pks +E. coli共同接种显着降少了黏液厚度，效果类似于结肠黏蛋白降解细菌A. muciniphila(图4C)。
这些结果表明ETBF通过降解黏液促进pks +E. coli的定植。pks +E. coli生态位的转变促进其分泌的colibactin(DNA损伤性毒素)向结肠上皮细胞的递送。与此假设一致，与pks +E. coli或ETBF单株接种小鼠相比，γ-H2AX免疫组化结果发现pks +E. coli和ETBF共同接种的AOM小鼠的结肠上皮细胞的DNA损伤显着增强(图4D)。
本研究表明，超过一半的FAP患者存在ETBF和pks +E. coli，它们通过两个不同但相互补充的过程促进癌发生：(i)降解黏液使得pks +E. coli黏附增加，通过colibactin促进结肠上皮细胞DNA损伤(图4D); (ii)共同接种条件下，pks +E. coli早期增强ETBF诱导的IL-17分泌(图3，D和E)。ETBF和pks +E. coli共同接种与上述机制协同诱导AOM小鼠的肿瘤发生。
ETBF和pks +E. coli通常定植在全球范围的儿童体内。因此，本研究结果表明，在年龄小的时候，这两种菌在结肠黏膜持续定植可能有助于FAP的发病，甚至可能发展为散发性CRC，因为APC丢失或突变发生在绝大多数散发性CRC中。这些研究结果表明，bft和clbB的共表达分析可能对一般筛选和预防CRC上有参考价值。
本文由莫孞编译，莫秋芬、江舜尧编辑。