科研 | Water Research: 环境选择决定了近地表地下水微生物群落的形成
编译：gu作成熟，编辑：小菌菌、江舜尧。
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水动力学通过通过跨越地理障碍迁移微生物并产生选择性压力的变化，驱动着水生生境中随机和确定性的群落聚集。因此，水文地质环境的异质性以及来自补给区的周期性地表输入在可能在地下水微生物群落的形成和维持方面发挥重要作用。
本文在海尼希国家公园临界区进行探测，通过在一个山坡横断面上的碳酸盐-硅质混合碎屑岩变化环境中进行了三年的观测，阐明了地下水微生物群落分化机制。
① 方差分解分析结果表明水化学(35.0%)和空间距离(18.6%)对地下水微生物群落形成的重要作用，而不是时间的作用。
② 地下水以稀有物种（99.6%的OTUs）为主，占总读取量的25.9%，而被鉴定为核心物种的OTUs只有26种。靠近补给区微生物多样性高，与高地表输入相吻合。在下游方向，稀有OTUs的丰度下降，而核心OTUs丰度上升至47%，说明选择压力增大，物种定殖的竞争成本增加。
③ 一般而言，环境选择是驱动地下水微生物群落空间分化的关键机制，其中N-化合物和溶解氧为主要决定因素，并在流速较低的上部含水层中尤为突出。在流速较高的低含水层，随机过程对群落的聚集起着重要的作用。
总的来说，这项研究强调了地表和地下条件以及流动方式和相关的栖息地可及性对地下水微生物群落的影响。
论文ID
原名：Environmental selection shapes the formation of near-surface ground water microbiomes
译名：环境选择决定了近地表地下水微生物群落的形成
期刊：Water Research
IF：7.913
发表时间：2019.11
通讯作者：Kirsten Küsel
作者单位：耶拿弗里德里希·席勒大学生物多样性研究所
实验设计
本文在德国图林西北部的海尼希山坡地下水流动系统的薄层海洋沉积物的检测井中的地下水进行取样。该实验连续进行3年，每间隔3个月对不同的山坡位置和深度(5-~ 90m)的地下水进行采样。在每次取样过程中，使用潜水取样泵从每口井的无菌瓶中收集约5-6升的地下水。使用PowerSoil DNA Isolation kit 对其进行DNA提取，并使用Bakt_0341F 和 Bakt_0785R对提取的DNA 的16S rRNA gene进行序列扩增。利用Illumina对扩增子进行测序。最后对测序结果从生物信息学方面、细菌多样性、群落组成和beta多样性模式、物种等级丰度分布、核心和稀有物种的量化以及水化学性质与微生物之间的联系进行了分析。
结果
1 环境选择塑造了地下水中的细菌群落
根据不同的水化学特征，地下水样品被分成五个组。如图1A所示，细菌群落组成显示出更高分辨率，因为，探测井H41和2个H3（H31和H32）的探测井的细菌群落组成在无约束排序中有显著不同（图1B）。通过TSS and CSS 方法，这些稀少的数据产生了类似的微生物群落分组模式。因此，我们根据H41地下水细菌群落的Silhouette analysis，将微生物群落簇（mCluster）的数量优化为6个（图1B）。微生物群落数据的巨大变化(45%)可以用定义的mClusters存在空间效应来解释(PERMANOVA, p <0.001)。
根据变异划分分析（图1C），横断面的水化学差异是细菌群落组成变化的最大部分(35.0%)，其次是空间距离(18.6%)。两种解释基质对细菌群落均有显著影响(p < 0.001)，且在横断面上细菌群落的变异率均为9.1%。令人惊讶的是，细菌群落的时间变化并不明显（图1C）。
图1 A）Kohlhepp et al. (2017)修改的海尼希样带的单个山坡上的两个含水层组合的地下水井中的水化学性质和微生物群落的聚类模式。B)基于Bray-Curtis距离的主坐标分析(PCoA)可视化微生物群落簇(mClusters)。在多元正态分布的情况下，mClusters 95%的置信度椭圆以圆点表示。使用基于Bray-Curtis距离的PERMANOVA (adonis函数)检测了mClusters之间的成分差异。C)用空间距离、时间(采样活动)和水文参数三个解释矩阵表示地下水细菌群落组成变化比例(调整R2)的维恩图。按排列检验三种解释基质对细菌群落组成影响的显著性水平:***，p < 0.001, ns不显著。简称:水化学聚类、微生物群落聚类、HTL下含水层组合、HTU上含水层组合。
水化学簇的特征是Kohlhepp等人(2017) 利用PCA图对相应3个月基础样品的水化学参数进行了表征（图2A）我们使用基于距离的冗余分析来调查横断面上细菌群落空间差异的潜在水化学驱动因素。在测得的水化学参数中，铵，硝酸盐，溶解氧，氧化还原电位，总无机碳（TIC），铁（II）和氯化物解释了横断面细菌群落数据的30.1％变异（已调整）（图2B）。有趣的是，H51与其他井中的硫(或硫酸盐)浓度和电导率(EC)(图2A)对细菌群落组成没有显著影响(图2B)。总地来说，氮和氧的可得性是造成细菌组成差异的关键因素。
在上含水层组合中，显著的水化学参数(铵态氮、氧化还原电位和pH值)解释了细菌群落数据差异的33.6%（图2C）。在整个低含水层组合中，铵根、亚硝酸盐和TIC显著地改变了细菌群落的空间分布（图2D）。然而，在低含水层这些水化学参数解释了较低比例(8.2%)细菌群落的变化。下、上含水层群落组成的解释差异说明了地下水群落聚集的不同机制。因此，我们结合系统发育和基于丰度的零模型，分别阐明了确定性和随机性过程对两个含水层组合中水文连通井之间空间群落更替的不同影响。实际上，环境变量的选择是整个上含水层组合中细菌群落之间组成转换率较高的主要原因。仅H42和H43相邻孔间具有相似的系统发育和组成结构的组分周转率，这主要是随机过程所致。在整个较低的含水层中，由于随机聚集（主要是扩散限制），我们观察到了群落之间更高的组成转换。bNTI和RCbray的值与预期的相似，说明H41和H51群落的系统发育和组成差异主要是随机过程造成的。
图2 使用A) PCA图描述预先定义的水化学簇，db-RDA图显示地下水中细菌群落和重要环境变量之间的关系B)整个横断面上所有井的细菌群落与重要环境变量之间的关系。C）整个上层含水层水文连通井组合细菌群落与重要环境变量之间的关系(HTU) D) 使用跨下部含水层组合（HTL）的水文连通井的D）将微生物群落与横断面的水化学联系起来。在基于999个排列的db-RDA图中，只有重要的水化学因子（p <0.05）被绘制为向量。矢量标签后面方括号中的符号表示约束性水化学变量对群落数据的显着影响（*** p <0.001，** p <0.01，* p <0.05）。缩写：ORP氧化还原电位（使用普通氢电极），DO溶解氧，Iron2铁2þ，DOC溶解有机碳，TOC总有机碳，TIC总无机碳，R2在细菌群落数据中的变化比例由水化学参数解释。
2 靠近补给区地下水中具有更高的细菌多样性
横断面细菌群落多样性的特征（图3A）表明，靠近表面补给（露头）区域的上Muschelkalk地层的群落多样性最大，H14的平均香农指数为6.68±0.45，5.74±5.77。在H13处，而在山坡上的缺氧井的多样性最低（H53：4.33±0.46，H52：4.54±0.40）。
所有地下水群落均以物种丰富度分布的“峰尾模式”为特征，只有少数优势种和大多数低丰度稀有种。尤其是在H14井中，观察到大量稀有物种，如等级丰度曲线的长尾巴所示。这种优势模式在H52和H53两个群落中最为明显，其中OTU000001(未被培养的一个类群)以Thermodesulfovibrionia为优势种，其相对丰度平均分别为13.7%和18.7%。MDS排序的前两个坐标解释了等级丰度分布的归一化距离的大部分（92％）（图3B），将等级丰度结构清楚地分为三组：i）上坡群（mCluster1 ），ii）缺氧的山坡群（mCluster 5）和iii）其他mCluster（mCluster 2、3、4和6）。衰减系数（与相对丰度的对数相对于等级对数的拟合曲线的斜率）对于H53最低（-1.1），对于H14最高（-0.6）。Zipf衰减系数越小，说明相邻等级的OTUs丰度下降越明显，对应的地下水微生物群落物种丰度分布模式越不均匀。
在地下水微生物群落中，大多数(99.6%)的OTUs是稀有物种(定义为平均相对丰度低于0.01%)，这些稀有物种加在一起代表横断面的平均相对丰度为25.9%。具体来说，稀有物种的相对丰度随地下水排放而下降(mCluster 1: 25.2% vs. mCluster 5: 11.1%)。稀有种主要隶属于Patescibacteria(平均相对丰度7.9%)、Proteobacteria(6.2%)、unclassified bacteria(3.2%)、Omnitrophicaeota(1.6%)、Chloroflexi （1.0）和Planctomycetes (1.0%)。有趣的是，在横断面的细菌群落中，属于第三丰富门的稀有物种仅占相对丰度的0.4%。
图3 A) Shannon多样性指数与B)地下水细菌群落等级丰度正态分布的空间格局。利用该方法对地下水井间的Shannon值进行了全局检验。克鲁斯卡尔-沃利斯。根据Dunn的多次对比测试，图中框上不同小写字母表示井间alpha多样性值存在显著差异。对于丰度分布曲线，实线表示均值归一化丰度，阴影区域表示均值的95%置信区间。图B中MDS的排序。
3 在下游方向上核心地下水细菌种类在地下水中占主导地位
下一步，我们确定了优势地下水细菌的分类组成。在门级水平上，在地下水细菌群落中，Cand. Patecibacteria（平均相对丰度：33.8％）和Proteobacteria（24.0％）占主导地位（图4A）。在种水平上，Cand. Parcubacteria占主导地位，相对丰度在H51中为11.5%±3.5%，在H32中为27.8%±8.6%。Gammaproteobacteria是第二大类群，平均相对丰度在H32中为9.5%±2.3%，H13中为16.3%±9.2%，其次为Alphaproteobacteria (H52为1.1%±0.6%，H13为11.9%±9.6%)。有趣的是，随着沿该样带山坡的流体流动（图4A），Thermodesulfovibrionia的相对丰度增加，从H1井的不到0.01％增加到H53井的21.2％。
我们确定了核心物种，因为它们被认为代表了地下水群落的稳定部分，无论时间和空间。然而，这26个OTUs数量相当丰富，占整个群落相对丰度的21.6% (图4B)。这些核心OTUs被分为9门14种：Proteobacteria(8 OTUs), Cand. Patescibacteria (7 OTUs), Nitrospirae (2 OTUs), Planctomycetes(2 OTU), Elusimicrobia (2 OTUs), Chloroflexi (2 OTUs), Actinobacteria (1 OTU),Bacteroidetes (1 OTU), and Gemmatimonadetes (1 OTU)。
核心OTUs的相对丰度从上山坡到下斜坡增加了8倍(H13增加5.7%，H53增加46.8%)（图4B）。当我们将核心OTUs (在类水平上)的分布模式与水化学参数进行关联时，它们主要根据细菌对氧和氮化合物(铵和硝酸盐)的可用性分为四组。第一组核心类群（Nitrospira(1 OTU assigned to the genus Nitrospira), JG30-KF-CM66 (1 OTU with no closecultured relative)）的丰度与氧、硝酸盐、电导率和硫酸盐呈显著正相关（图4C）。因此，H31、H41、H51的含氧下含水层井中富集了这些核心类菌群。第2组核心类别的丰富度与铵，pH，镁和钾呈正相关，而与氧和钙呈负相关（图4C）。大多数核心类，如Thermodesulfovibrionia(1个未培养的OTU)、Gammaproteobacteria(5个OTUs，分别属于Acidiferrobacteraceae、Rhodoferax、GOUTA6、Sulfuritalea和TRA3-20)、Cand. Parcubacteria(3个OTU分配Candidatus Kaiserbacteria，2个OTU分配给Candidatus Nomurabacteria，1个OTU分配给UBA9983)，Actinobacteria (1个OTU分配给Candidatus Planktophila)，以及Deltaproteobacteria(1个未分类的OTU)，聚集在第2组，在排水后相对丰度显著增加 (图4D)。这些核心菌种也在坡地上得到了富集(图4D，Brocadiae为第三组的代表)。Alphaproteobacteria (Group 4,1 unclassified OTU和1 Caulobacteriaceae OTU)的丰度与实测的水化学参数不相关，因此在孔间的丰度差异较弱。因此，大多数核心种表现出对某些水化学条件的特殊偏好，这些水化学条件沿山坡而变化。
图4 条形图显示了A)整个细菌群落和B)横断面上的核心群落(包括26个核心otu)的平均分类学特征。C)热图和分层聚类显示了核心类的丰度与测量的水化学参数之间的相关模式。D)箱形图，说明每个集群组(组)中具有代表性(最丰富)的核心类(由所有隶属于相应类的核心otu组成)的空间格局。对核心类之间的丰度差异进行全局测试。缩写:RA的相对丰度每个细菌类,大道的平均丰度类在横断面(平均101个样本),MRAcore(%)的平均相对丰富的核心社区占相应的样本,ORP氧化还原电位(与正常氢电极),溶解氧,EC导电性,抽搐总无机碳,TOC总有机碳,DOC溶解有机碳Iron2铁2þ,ns与Spearman无显著相关(校正p > 0.05)
讨论
1 环境选择决定了微生物群落在空间上的组成差异
我们的统计和建模方法表明，当地的水文地质环境导致了不同的地下水微生物群落的形成。微生物群落结构比单纯的水化学参数表现出更精细的空间分异，这与以往的地下水微生物群落研究一致。我们确定了氮化合物、溶解氧和到地表的距离是微生物群落组成的主要驱动因素，这与之前对Hainich含水层系统的研究类似。微生物生长所必需的元素，如钙、镁、钾、钠，在石灰岩-泥岩交替中含量充足，对细菌群落组成影响不大。这些参数沿流向的浓度增加或减少是由于长时间的停留和跨层水交换造成的，这为坡体的流态和水文结构的作用提供了线索。微生物组数据的巨大变化（59%）不能用测量的水化学参数、空间距离或时间来解释，这表明由于水生地质结构的异质性以及不可测的水文地质特性，地表事件，流态和可利用性，以及其他生物相互作用（例如掠食，病毒或同养）在塑造地下水微生物群系中也发挥了重要作用。
由于上层含水层流速较低，生物可能获得足够的时间来响应和适应当地环境。水文地质参数，如铵态氮、pH值、氧化还原电位以及未测量的因素，可能选择了具有特定特征的物种，这些特征使它们在相应的栖息地胜过其他物种，从而导致了上层含水层组合的高空间系统发育周转率。在缺氧H5井中观察到的细菌群落丰度分布不均匀，有力地支持了空模型的结果，即环境变量选择是压倒一切的群落形成机制。Zipf’s定律最初是由语言中的词频研究引起的，已被用来模拟物种多样性在高度多样化的植物和细菌群落中对物种数量的依赖性。在Zipf模型中，一个物种进入一个群落依赖于在一个先前环境连续变化，在这个过程中，由于竞争的成本比先前的殖民者要高，后来进入的物种数量较少。在这项研究中，观察到mCluster 5的等级丰度分布的最低衰减系数，表明进入mCluster 5的新物种的定居成本比其他mClusters高得多。H42井和H43井为地质相邻井。这两口井间的低系统发育和成分转换可能是由于种群规模的随机变化造成的。
在整个低(含氧)含水层中，扩散限制对细菌群落的聚集更为重要，因此忽略了环境选择的明显影响。该结果与最近对Hainich地下水流系统中的细菌（包括超小型细菌（<0.2 mm））进行的群落组装分析相符。地下含水层井间微生物扩散或交换受阻，可能是由于地下水补给源不同、水力流动复杂、跨层水交换等原因造成的。硫酸根浓度在H51和H41之间的显著差异表明，除了优先补给流外，H51还有额外的地下水来源。然而，硫酸盐显然没有被用作电子受体，因为在H51上有更有利的电子受体，如氧、硝酸盐和亚硝酸盐。
2 近地表地下水细菌来源于地表生境，但它们的生存依赖于局部的相互作用
我们发现在临近补给区附近的上山坡的水井(特别是H14)中细菌多样性最高。生物群落有更广泛的适应选择。地下水质量对天气事件表现出快速反应，反映在地表来源的物质如溶解氧和土壤颗粒和植被产生的有机碳在大雨和融雪事件后的高可用性。因此，新鲜地表物质的输入可能刺激了地下水中机会性异养菌的生长，导致了细菌多样性的增加。然而，地下水中有机碳化合物(DOC和TOC)的浓度在时间和空间上没有明显的差异。这可能意味着有机化合物的生物利用度和/或组成对地下水细菌的多样性至关重要，与总浓度无关。Proteobacteria,Elusimicrobia, Chloroflexi, Actinobacteria, Bacteroidetes, and Gemmatimonadetes广泛存在于地下水中。这些类群，特别是Bacteroidetes，在山坡上的水井(尤其是H14)中大量存在，并被认为在复杂地表物质(如多糖)的分解中起着关键作用。
另一方面，细菌的多样性可能直接受到外源物质输入的影响，这些外源物质输是通过将地表细菌输送到地下水中来实现的。这种细菌的间歇输入可能是地下水微生物群的主要来源，因为在同一研究地点的岩石基质中只发现了一小部分细菌（<12%）是来源于远洋地下水输入的。最近，研究表明Cand. Patescibacteria优先从表层土壤进入地下水，这可能是由于它们的细胞非常小。Cand.Patescibacteria是在我们的地下水系统中发现的优势门，是不可培养的CPR细菌，CPR细菌估计构成了全球所有细菌多样性的一半。在地下低营养环境下，对常驻微生物的选择性压力可能主要是为了生存和休眠，而不是为了资源的开发。因此，Cand. Patescibacteria的丰度很高，Cand.Patescibacteria的高分散能力和/或适应策略表明，它们在地下环境中生存所需的营养和能量很低。令人惊讶地是，在岩石层还没有发现Cand.Patescibacteria。这些发现表明，浅层含水层的细菌多样性极有可能是由表层土壤栖息地引入的，此外，还有一小部分细菌是通过种群交换从岩石裂缝中引入的。
我们研究了等级丰度分布，以揭示整个空间中细菌物种的独特分布模式（即优势度和稀有度）。我们在地下水中观察到一小部分优势OTUs，但绝大多数(99.6%)是相对丰度较低的稀有物种，这与其他在不同环境中的微生物群落研究一致。这些稀有物种在地下水过程中的生态作用尚不清楚，但它们明显的低丰度并不意味着它们在生态系统功能中的作用微不足道。“稀有生物圈”可能正处于邻近生态位之间的传播过程中，在这些生态位中它们可能成为优势，或者稀有物种充当遗传资源，并且可以应对环境干扰。因此，在我们现场观察到的稀有物种丰度的减少和排放后优势物种丰度的增加反映了微生物的扩散，更重要的是反映了环境的选择过程。
随着时间的推移，我们在横断面上只确定了26个核心OTUs，揭示了地下水微生物群落中物种组成的巨大时空变化。然而，这些核心OTUs加起来代表了整个群落的五分之一以上，似乎合理地反映了他们的生活方式，很好地适应了近地表地下水的生活条件，例如兼性厌氧生物、自养生物、对低基质可利用性的适应。这些核心OTUs很可能是在地下水中存活下来并发展成主要群落，因为它们在特殊的地下条件下最具竞争力。
随着地下水的排放，岩心物种的相对丰度增加，缺氧H5井的相对丰度达到峰值(>35%)，反映出岩心物种对日益增加的地下影响的重要性。结果表明，随着地下水流量的增加，亚硝基螺的丰度明显增加，属于Nitrospirae的物种较少，属于稀有物种，说明Nitrospirae在地下水系统中的非随机空间分布格局。Nitrospirae属包括著名的硝化细菌，最近的研究发现它们具有代谢潜力，可以在缺氧条件下将氨完全氧化为硝酸盐。在含氧地下水环境中，核心亚硝基螺种的丰度与铵态氮呈负相关，与硝酸盐呈正相关，这可能反映了它们作为亚硝酸盐氧化剂和氨氧化细菌的潜在作用(完全氨氧化剂)。核心Thermodesulfovibrionia在低氧、低硝酸盐和富含氨的地下水群落中占优势，这表明它们在缺氧底坡井中养分(特别是氮)周转方面的潜力增大。
结论
我们的数据表明，跨空间的地下环境异质性和优先补给区的地表输入都影响浅层沉积基岩含水层中浮游细菌群落的形成和生存。
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