科研 | Microbiome：高度污染鸡粪便中空肠弯曲杆菌分离方法的宏基因组学分析
编译：Mushroom，编辑：小菌菌、江舜尧。
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空肠弯曲杆菌源于家禽，尤其是鸡，是世界范围内主要的食源性致病菌，也是弯曲杆菌病的主要病因。由于空肠弯曲杆菌培养条件严苛以及样品中存在的竞争性菌群的干扰，所以很难被分离出来。本实验应用14种不同的空肠弯曲杆菌分离方法对35份鸡粪便样品进行处理。这14种方法使用了不同的富集肉汤培养基、选择性琼脂培养基以及不同梯度的样品稀释度。利用宏基因组学结合培养法对富集过程及选择性培养基的效果进行了评估。在富集过程中，无论何种类型的富集培养基，微生物多样性都显著下降，其中粪便与培养基的比例为1:103时下降最为显著。特别是在103倍稀释的普雷斯顿肉汤培养基中，空肠弯曲杆菌的相对丰度增加，而干扰弯曲杆菌分离的产广谱β-内酰胺酶大肠杆菌的相对丰度降低。此外，在103 倍稀释的普雷斯顿肉汤培养基中富集时，在mCCDA上分离出的空肠弯曲杆菌数量明显多于普雷斯顿琼脂。本研究首次应用宏基因组学评价从鸡粪便中分离空肠弯曲杆菌的方法。由此可见，宏基因组学技术可用于改进难以培养细菌的分离方法。
论文ID
原名：Metagenomic analysis of isolation methods of a targeted microbe, Campylobacter jejuni, from chicken feces with high microbial contamination
译名：高度污染鸡粪便中空肠弯曲杆菌分离方法的宏基因组学分析
期刊：Microbiome
IF：10.465
发表时间：2019.04.25
通讯作者：Seongbeom Cho
作者单位：韩国兽医科学研究所和首尔国立大学兽医学院
实验设计
结果
1不同方法对空肠弯曲杆菌和竞争性细菌的分离结果
未经过富集处理的样品中，mCCDA的空肠弯曲杆菌分离率为45.7%（16/35），普雷斯顿琼脂的空肠弯曲杆菌分离率为57.1%（20/35）（图1）。在用波顿肉汤培养基的富集样品中，无论样品与富集肉汤培养基的比例和选择性琼脂的种类如何，都不能分离到空肠弯曲杆菌。在普雷斯顿肉汤- mCCDA的方法中，当样品与普雷斯顿肉汤的比例为1:101时，未分离出空肠弯曲杆菌，而当比例为1:102和1:103时空肠弯曲杆菌分离率分别达到31.4%（11/35）和97.1%（34/35）。在普雷斯顿肉汤-普雷斯顿琼脂方法中，当样品与富集液的比例为1:101和1:102时都没有分离出空肠弯曲杆菌，而在比例为1:103时分离出5.7%（2/35）的空肠弯曲杆菌。在103倍稀释的普雷斯顿肉汤-mCCDA方法中空肠弯曲杆菌的分离率显著高于其他方法（卡方检验，p < 0.05）。并且102倍稀释的普雷斯顿肉汤-mCCDA方法中空肠弯曲杆菌的分离率也显著高于其他方法（卡方检验，p < 0.05，表1）
图1 实验流程图。应用宏基因组学和培养法对所有鸡粪便样本进行分析，比较不同方法对空肠弯曲杆菌的分离结果。
表1 不同方法对空肠弯曲杆菌和竞争性细菌的分离结果。
a代表选择性琼脂培养基不同，其他条件均相同时出现的显著性差异。b代表样品与富集肉汤培养基的比例不同，其他条件均相同时出现的显著性差异。c代表富集肉汤的类型不同，其他条件均相同时出现的显著性差异。
此外，所有的方法均分离到了作为空肠弯曲杆菌竞争性细菌的产ESBL大肠杆菌、奇异变形杆菌和肠球菌（表1）。相同培养条件下，产ESBL大肠杆菌在mCCDA中的分离率明显高于普雷斯顿琼脂；在波顿肉汤培养基中的分离率显著高于普雷斯顿肉汤培养基（卡方检验，p< 0.05）；103倍稀释的波顿肉汤-普雷斯顿琼脂对产ESBL大肠杆菌的分离率显著高于103倍稀释的普雷斯顿肉汤-mCCDA（卡方检验，p < 0.05）；普雷斯顿琼脂对奇异变形杆菌的分离率显著高于mCCDA（卡方检验，p < 0.05）；波顿肉汤培养基中没有分离出肠球菌，mCCDA对肠球菌的分离率明显高于普雷斯顿琼脂（卡方检验，p <0.05）。
2 不同方法分离竞争性细菌的比例及其与空肠弯曲杆菌分离结果的关系
以各菌落数与平板上除空肠弯曲杆菌外的独立菌落总数之比作为判定竞争性细菌比例的标准。按富集液类型比较各菌的比例，发现产ESBL大肠杆菌的比例有显著差异（未经过富集过程22.9±39.3%，波顿肉汤培养基38.1±40.9%，普雷斯顿肉汤培养基10.7±26.1%，p < 0.01），而奇异变形杆菌无显著差异（图2 a，b）。根据选择性琼脂的不同比较各菌群比例，发现产ESBL大肠杆菌（mCCDA 41.8 ± 40.8%，普雷斯顿琼脂6.9 ±22.2%，p < 0.01）和奇异变形杆菌（mCCDA 36.0 ±39.5%，普雷斯顿琼脂86.5 ± 31.7%，p < 0.01）均具有显著性差异。根据样品与富集肉汤的比例比较各微生物的比例，显示在103倍稀释的波顿肉汤中产ESBL大肠杆菌的比例显著高于奇异变形杆菌。
图2 不同方法分离竞争性细菌的比例。
（a）产ESBL大肠杆菌。（b）奇异变形杆菌。
此外，应用14种方法对35个样品，总共490个样品处理中，分离到产ESBL大肠杆菌和奇异变形杆菌的比例显著不同（图3a，3b）。在83个分离到空肠弯曲杆菌的平板和407个未分离到空肠弯曲杆菌的平板上产ESBL大肠杆菌的比例分别是15.9 ± 32.8% 和 25.9 ±22.2%（p< 0.05），奇异变形杆菌的比例分别是40.5 ± 46.7% 和 65.0 ± 42.1%（p< 0.01）。
图3 利用培养法测定竞争性菌群对空肠弯曲杆菌分离的影响。
（a）产ESBL大肠杆菌的比例。（b）奇异变形杆菌的比例。产ESBL大肠杆菌和奇异变形杆菌的比例在空肠弯曲杆菌阴性粪品中显著升高。
3 宏基因组分析不同富集过程鸡粪便中微生物群落多样性
将54个样品（用7种方法处理的7个粪便样品和另外4个以103倍稀释于普雷斯顿肉汤中的粪便样品，还有一个未经富集的粪便样品）进行宏基因组学测序。结果显示，随着粪便样品富集程度的提高，OTUs的数量呈下降趋势（图4a）。此外，未经富集处理的粪便样品中OTUs的数量显著高于103倍稀释的波顿肉汤（Mann-WhitneyU检验，p< 0.05）和103倍稀释的普雷斯顿肉汤（Mann-Whitney U检验，p < 0.01）的处理。样品与富集肉汤比例相同的条件下，在各富集肉汤的类型间OTUs的数量无显著性差异；Shannon指数在不同的富集肉汤类型之间也无显著性差异，但Shannon指数随着样品与富集肉汤比例的降低而降低（图4b），尤其是在103倍稀释的波顿肉汤和103倍稀释的普雷斯顿肉汤培养基中（Mann-Whitney U检验，p < 0.05）。此外，在Faith的系统发育多样性上，各类型富集肉汤之间无明显差异，而随着样品与富集肉汤比例的降低，该值趋于下降（图4c）。其中，在103倍稀释的普雷斯顿肉汤中富集的粪便样品Faith系统发育多样性显著降低（Mann-Whitney U检验，p < 0.05）。
图4 宏基因组学分析7个富集过程的α多样性。
（a）OTUs的数量。（b）Shannon多样性指数。（c）Faith系统发育多样性。富集过程中，随着样品与富集液比例的降低，粪便样品的OTUs的数量、微生物丰度和均匀度以及微生物的丰富度均显著降低。
利用主坐标分析（PCoA）图和热图对7个富集过程中粪便样品的微生物群落进行了比较，未富集的鸡粪便和在波顿肉汤中富集的粪便样品中的微生物都没有聚集在一起。在101/102倍稀释的普雷斯顿肉汤中富集的粪便样品也没有聚集在一起。然而，在103倍稀释的普雷斯顿肉汤中富集的粪便样品明显聚集在一起（图5a）。在热图上与PCoA图一样，只有在103倍稀释的普雷斯顿肉汤中富集的粪便样品聚集在一起，其他方法都是分散的（图5b）。通过置换多元方差分析（PERMANOVA）和相似性分析（ANOSIM）检测各组间的差异，发现103倍稀释的普雷斯顿肉汤富集方法与其他各组间有显著性差异（p< 0.001）。
图5 7种方法处理的粪便样品中微生物群落的相似性（n=54）。
（a）主坐标分析（PCoA）图。（b）热图。以1:103比例富集在普雷斯顿肉汤中的粪便样品聚集在一起。
4 宏基因组分析每个富集过程的粪便中核心微生物群落组成
属水平的核心分类学组成如图6a所示。在所有方法中，共鉴定了61个属，其中18个属构成了核心微生物群，占总菌群的98%以上。在未经富集处理的粪便中，主要的核心菌群包括志贺氏杆菌（35.8%），乳酸菌（27.6%）、梭状芽胞杆菌（10.8%）和消化链球菌（10.3%）。在101倍稀释的波顿肉汤方法中，主要是变形杆菌（30.1%），其次是志贺氏杆菌（17.2%）和嗜胆菌（11.9%）；在102倍稀释的波顿肉汤方法中，志贺氏杆菌（24.5%）和变形杆菌（22.9%）是主要的核心菌群；在103倍稀释的波顿肉汤方法中，志贺氏杆菌（64.6%）是主要的核心菌群。在101倍稀释的普雷斯顿肉汤方法中，主要是变形杆菌（35.9%），其次是消化链球菌（25.9%）和志贺氏杆菌（11.1%）；在102倍稀释的普雷斯顿肉汤方法中，变形杆菌（38.9%）和弯曲杆菌（21.0%）为主要的核心菌群；在103倍稀释的普雷斯顿肉汤方法中，弯曲杆菌（43.7%）是主要的核心菌群，其次是变形杆菌（38.7%）。
5 宏基因组分析各富集过程的粪便中弯曲杆菌和竞争性菌群的相对丰度
未经过富集处理的粪便样品和富集于波顿肉汤的粪便样品中弯曲杆菌的相对丰度较低，而富集于普雷斯顿肉汤的粪便样品中弯曲杆菌的相对丰度随着样品与肉汤比例的降低而增加（图6b）。特别是在103（43.7%）和102（21.0%）倍稀释的普雷斯顿肉汤富集的的粪便样品中弯曲杆菌的相对丰度显著高于其他方法（Mann-WhitneyU检验，p< 0.01），并且103倍稀释的普雷斯顿肉汤中弯曲杆菌的相对丰度显著高于102倍稀释的普雷斯顿肉汤（Mann-Whitney U检验，p < 0.05 ）。普雷斯顿肉汤粪样中志贺氏杆菌的相对丰度较粪便中有所降低（图6b），并且这类细菌的丰度是随着样品与普雷斯顿肉汤比例的下降而下降的，尤其是在103倍稀释的普雷斯顿肉汤中（Mann-Whitney U 检验，p < 0.01）。然而，与其他方法相比，在103倍稀释的波顿肉汤富集的粪便样品中，志贺氏杆菌显著增加。（Mann-WhitneyU检验，p < 0.05）。而对于变形杆菌，未经富集过程的粪便样品中相对丰度仅为0.8%，而在富集肉汤中，无论样品与肉汤的比例如何，除了103倍稀释的波顿肉汤外相对丰度均显著增加（Mann-Whitney U 检验，p < 0.01）（图6b）。除未经富集处理的粪便外，用103倍稀释的波顿肉汤处理的粪便样品中变形杆菌的丰度明显低于其他方法（Mann-WhitneyU检测，p< 0.01）。对103倍稀释的普雷斯顿肉汤与其他方法（未经富集和103倍稀释的波顿肉汤）进行线性判别分析（LEfSe），结果也都一致。
图6 粪便样品经不同方法处理后在属水平上的微生物群落分析。
（a）分类学组成。（b）每个方法中弯曲杆菌、志贺氏杆菌和变形杆菌的相对丰度（最小到最大）。103倍稀释的普雷斯顿肉汤粪样中弯曲杆菌的相对丰度明显高于其他方法。相对于原粪便样品，富集过程中志贺氏杆菌的相对丰度有所降低，但在101/102倍稀释的波顿肉汤富集过程中仍有大量存在。对于变形杆菌，除了103倍稀释的波顿肉汤外，在所有样品富集液比例的两种富集液类型中变形杆菌的相对丰度均有所增加。
在相关分析中，弯曲杆菌与变形杆菌呈负相关（皮尔森相关系数（r） - 0.39），并且在波顿肉汤中，不管样品与肉汤的比例如何，志贺氏杆菌与变形杆菌也呈负相关（r -0.82）。在普雷斯顿肉汤中，无论样品与肉汤的比例如何，弯曲杆菌与包括志贺氏杆菌在内的几乎所有微生物都呈负相关（r -0.54）。
6 宏基因组学和培养法确定竞争性菌群与空肠弯曲杆菌的关系
54个样品经宏基因组学分析后分为两组；17个样品呈空肠弯曲杆菌阳性，37个样品呈阴性。基于分离培养结果，在空肠弯曲杆菌的阳性样品中弯曲杆菌的相对丰度明显较高（p < 0.01，图7a），大肠杆菌的相对丰度明显较低（p <0.05，图7b）变形杆菌相对丰度则无显著性差异（图7c）。
图7参照空肠弯曲杆菌的分离结果展示各菌的相对丰度。
（a）弯曲杆菌。（b）大肠杆菌。（c）变形杆菌。
7 定量PCR验证宏基因组学数据
对所有54个样品进行了空肠弯曲杆菌的定量PCR（qPCR），以验证宏基因组学数据的准确性，并估计每个方法中空肠弯曲杆菌的水平。通过标准曲线计算空肠弯曲杆菌的log CFU/ml为0.2±0.2（未经富集），0.7±0.7（101倍稀释的波顿肉汤），0.9±0.9（102倍稀释的波顿肉汤），3.9±1.5（103倍稀释的波顿肉汤），2.8±1.5（101倍稀释的普雷斯顿肉汤），7.3±1.3（102倍稀释的普雷斯顿肉汤）及10.2±0.2（103倍稀释的普雷斯顿肉汤）（图8a）。在103倍稀释的普雷斯顿肉汤富集的粪便样品中空肠弯曲杆菌的数量显著高于其他方法（Mann-WhitneyU检测，p <0.05）。102倍稀释的普雷斯顿肉汤的粪便样品中空肠弯曲杆菌的含量，除了103倍稀释的普雷斯顿/波顿肉汤外也显著高于其他方法（Mann-Whitney U检验，p < 0.05）。此外，我们还检验了从qPCR结果中得出的Ct值与宏基因组学结果中弯曲杆菌数量之间的相关性（y=-0.0009x+25.416，R2= 0.664，p<0.001，图8b）。
图8 对所有54个样品进行空肠弯曲杆菌的定量PCR。
（a）通过标准曲线推断每个样品中空肠弯曲杆菌的log CFU/ml。（b）宏基因组学数据与定量PCR结果的相关性研究。在103倍稀释的普雷斯顿肉汤富集的粪便样品中空肠弯曲杆菌的数量显著升高，为1.0×1010.2±0.2。其次是102倍稀释的普雷斯顿肉汤（1.0 × 107.3±1.3）和103倍稀释的波顿肉汤（1.0×103.9±1.5）。此外，qPCR结果的循环阈值（Ct）与宏基因组学测得的弯曲杆菌的数量具有高度相关性。
结论
1普雷斯顿肉汤比波顿肉汤更能有效地从鸡粪便中分离空肠弯曲杆菌，而波顿肉汤广泛用于从鸡肉中分离空肠弯曲杆菌。
2在103 倍稀释的普雷斯顿肉汤培养基中富集时，在mCCDA上分离出的空肠弯曲杆菌数量明显多于普雷斯顿琼脂。
3在分离微生物时，虽然应考虑富集肉汤的类型和比例，但选择性琼脂的类型也很重要。
结论
本研究首次应用以序列为基础的宏基因组学来评价鸡粪便中空肠弯曲杆菌的分离方法。由于空肠弯曲杆菌严苛的生长条件以及粪便中复杂的竞争性菌群的影响，弯曲杆菌难以分离培养。近年来，随着对食源性病原检测的重视，空肠弯曲杆菌的培养和检测得到了关注，特别是美国疾病控制中心食源性疾病监测部门，将具有高灵敏度和快速诊断能力，且不依赖于培养的诊断方法应用于弯曲杆菌感染的检测中，但是仅仅应用与培养无关的诊断方法而不对其进行分离培养，就无法对其去做进一步的分析。很多学者和技术人员已经开展了大量的从各种食源中分离空肠弯曲杆菌的方法，但是其中绝大多数研究都是使用轻度污染的鸡肉，而不是用高度污染的鸡粪。因此，为了提高从粪便中分离弯曲杆菌的效率，探索一种不同于从鸡肉分离弯曲杆菌的特定方法。本研究使用宏基因组学方法和培养法评估了从鸡粪便中分离空肠弯曲杆菌的方法。利用宏基因组学结合培养法对富集肉汤的类型和比例，以及选择性培养基的效果进行了评估。证实了在103 倍稀释的普雷斯顿肉汤培养基中富集时，在mCCDA上分离出的空肠弯曲杆菌最为有效。
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