雌、孕激素暴露时间及其血清浓度对人工周期冻融胚胎移植结局的影响
近年来，随着辅助生殖技术的不断发展，冻融胚胎移植（frozen-thawed embryo transfer，FET）周期数不断增多，而激素替代疗法（hormone replacement therapy，HRT）是FET周期准备子宫内膜的主要方法之一。HRT-FET周期中雌、孕激素的暴露时间及血清雌、孕激素水平是否影响FET的成功率？是否可以以此为切入点，改善FET的治疗结局？本文对此进行了综述。在HRT-FET周期，给予孕激素前过短时间的雌激素暴露可能增加早期流产率，血清雌激素水平与治疗结局无相关性。胚胎移植前孕激素的暴露时间影响治疗结局，胚胎移植日血清孕激素水平是持续妊娠和活产的独立预后因素。
冻融胚胎移植（frozen-thawed embryo transfer，FET）有很多优点，如增加累积妊娠率、降低辅助生殖技术的并发症，以及避免新鲜胚胎周期超生理水平甾体激素对子宫内膜的不良影响等［1］。此外，经FET成功妊娠者早产、子代低出生体质量及小于胎龄儿风险均低于新鲜胚胎移植者［2］。近10余年来FET周期数不断增加。目前，每移植2个胚胎，就有1个是冻融胚胎［3］。在某些国家，FET周期数甚至远远超过了新鲜胚胎移植周期数［4-5］。因此，如何提高FET周期的成功率成为人们关注的问题。
由于缺乏高质量的证据，FET周期最佳的子宫内膜准备方案仍然是一个不断争论的话题［6］，但各种方案都需遵循共同的原理，即建立接受性子宫内膜以及保证胚胎与子宫内膜发育之间的同步性。使用激素替代疗法（hormone replacement therapy，HRT）准备子宫内膜，可以安排移植日期、降低监测次数，在临床上是一种更受欢迎的方法［3］。早在20世纪80年代一些学者就制定了卵巢激素替代方案为胚胎移植做准备，尽可能地模拟正常的28 d排卵周期内卵巢激素的变化，即首先给予雌激素，引起子宫内膜增生，同时抑制优势卵泡的发育，直至内膜达到7~9 mm时给予孕激素，启动子宫内膜的分泌期转变［7-8］。近年来一些学者就如何优化这一方案，改善HRT-FET的治疗结局，进行了相关的研究。影响胚胎植入的因素有很多，本文就HRT-FET周期雌、孕激素的暴露时间及血清雌、孕激素水平与治疗结局的关系进行综述。
在卵泡期，雌激素促进子宫内膜腔上皮和腺上皮细胞的增殖，上调子宫内膜雌、孕激素受体，进而参与种植窗口子宫内膜基因表达的调控［9-10］。
1. 给予孕激素前雌激素的暴露时间是否影响HRT-FET的结局：在HRT-FET周期是否存在一个最佳的雌激素暴露时间？早期对赠卵周期的研究显示确实如此。Michalas等［11］报道给予孕激素前最佳的雌激素暴露时间是6~11 d，超过11 d则妊娠率显著下降。Younis等［12］则认为应将雌激素暴露时间限制在12~19 d之间，暴露时间不足12 d或超过19 d，妊娠率均会下降。但这些研究的样本量都很小。
1989年Navot等［13］对12例卵巢衰竭的女性进行HRT，结果显示暴露雌激素5 d即可为子宫内膜的增生和孕激素受体的诱导提供足够的刺激，添加孕激素后子宫内膜可以正常成熟。为验证子宫内膜这种形态学上的充分性是否反映了功能的完整性，这组学者又对44例接受供卵患者的临床结局进行了观察，结果表明短卵泡期方案组 （雌激素的暴露时间为5~10 d）的早期妊娠流产率显著高于长卵泡期方案组 （雌激素暴露时间为3~6周），作者得出结论：过短时间（5~10 d）的雌激素暴露会增加早期妊娠流产率［14］。Borini等［15］的研究进一步证实了这一结果。目前多数中心在给予孕激素前都保证雌激素的暴露时间≥10 d［16-17］。
是否存在雌激素暴露时间的上限？多数学者认为雌激素暴露的时间可以延长至5周以上而不会降低妊娠率［15，18］，近期一项对1439个HRT-FET周期的回顾性研究显示，当添加孕酮前雌激素的暴露时间在10 d以上时，不同的雌激素暴露时间（10~36 d）不影响着床率、临床妊娠率、早期流产率及活产率，新生儿出生体质量及低出生体质量儿的发生率差异也没有统计学意义［16］。但也有人认为过长时间的雌激素暴露会降低妊娠率和活产率［19-21］。Bourdon等［19］进行的多元回归分析表明，当冻融囊胚移植前雌激素的暴露时间超过28 d（给予孕激素前24 d）时，活产率显著下降，延长雌激素暴露时间（给予孕激素前32~44 d），新生儿出生体质量更低。作者推测在植入前超生理范围的长时间雌激素暴露可能会干扰蜕膜形成过程，影响胎盘形成，进而影响胎儿的生长。
综上，在HRT-FET周期，给予孕激素前雌激素的暴露时间对妊娠结局的影响结论不一。过短时间的雌激素暴露可能会增加早期妊娠流产的风险。对短期雌激素暴露反应不佳的患者，可以延长雌激素暴露的时间。但需注意，过长时间的雌激素暴露可能会增加子宫内膜突破性出血的概率，当雌激素暴露时间超过9周时，突破性出血的发生率大于44％［22］。另外，过长时间的雌激素暴露是否造成不良的妊娠结局，需进行前瞻性大样本研究。
2. HRT-FET周期血清雌激素水平是否影响FET结局：在自然周期中，随着卵泡的生长，雌激素水平逐渐升高，在晚卵泡期达到200 ng/L以上，持续至少50 h［23］。因此，临床医生通常希望HRT周期的血清雌激素浓度达到自然周期晚卵泡期的正常雌激素水平，即≥200 ng/L。但事实上HRT周期雌激素浓度应该维持在怎样的水平并不清楚。7项回顾性研究显示HRT周期孕激素转化日血清雌激素水平与妊娠结局不相关［17，24-29］。这7项研究中，雌激素测定的时间分别为给予孕激素前［17，24-28］或给予孕激素的第8~9日［29］，血清雌激素水平波动在52~3050 ng/L，观察指标包括人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）阳性率、着床率、临床妊娠率、流产率、继续妊娠率和活产率。
在2019年进行的一项前瞻性队列研究中，在HRT-FET周期移植单个整倍体囊胚，持续妊娠组和非持续妊娠组孕激素转化日血清雌激素水平差异无统计学意义（260 ng/L比286 ng/L，P=0.295）［30］。
HRT-FET周期是否存在雌激素水平的最低界值？上述研究都没有回答这一问题。Remohí等［24］对465个HRT移植周期进行的回顾性研究显示，在平均雌激素暴露时间相似的情况下（36.1~41.6 d）， 孕激素转化日雌二醇水平<100 ng/L组每移植周期的妊娠率、着床率和流产率与≥100 ng/L组差异没有统计学意义。但该研究中只有26个周期雌激素水平<100 ng/L，因此不能排除因样本量太小造成的误差。有些学者强调血清雌激素水平>100 ng/L是可以启用孕激素的条件之一［31］，如果雌激素水平<75 ng/L则取消移植［32］，但这些观点都缺乏相应的研究数据支持。
在HRT移植周期是否存在雌激素水平的上限？多数研究似乎并没有得出相关结论。既往对超促排卵周期的研究显示，过高的雌二醇水平可能对子宫内膜的接受性和胎盘形成产生不利影响，从而导致着床率下降［33-34］。Ma等［35］对小鼠模型的研究显示，高剂量的外源性雌激素可使子宫内膜从接受态转变为非接受态。Fritz等［36］的研究显示，当雌激素峰值<234 ng/L时，持续妊娠/活产率为54％，而当雌激素峰值>692 ng/L时，持续妊娠/活产率降至9％；此外，当平均血清雌激素水平≥330 ng/L时，无持续妊娠/活产发生。但该研究样本量小（110个周期），受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线下面积仅为0.62，预测的敏感度只有37.8%，因此结果的准确性还有待进一步验证。尽管如此，该研究还是提出警示：在HRT-FET周期，过高的雌激素水平可能对治疗结局不利。
已知不同的雌激素给药途径会导致不同的血清和局部组织雌激素浓度［37］，这可能影响不同研究的结果，在未来的研究中需关注这一点。
1. 胚胎移植前孕激素的暴露时间是否影响妊娠结局：
HRT-FET周期胚胎移植前最佳的孕激素暴露时间仍不清楚［39-40］。在自然周期血清孕酮水平在排卵日达到约1 μg/L［41］，着床发生在排卵后7 d。据此，在HRT移植周期将给予孕激素的第1日定为排卵日或排卵的第2日，移植方案包括胚胎日龄 1 d方案（第3日胚胎在给予孕酮的第4日移植，第5日胚胎在给予孕酮的第6日移植）和胚胎日龄 0 d方案（第3日胚胎在给予孕酮的第3日移植，第5日胚胎在给予孕酮的第5日移植）［42］。
但一些学者认为胚胎植入窗口似乎更宽，不一定要严格遵守上述时间。Navot等［14，43］在给予孕酮后的第1~6 d移植第2日和第3日胚胎，都可导致妊娠。van de Vijver等［44-45］的两项前瞻性研究显示，在孕激素暴露的第3日或第5日移植第4日胚胎，两组的着床率、临床妊娠率和活产率相似，而在孕激素暴露的第5日或第7日移植单个整倍体囊胚，两组之间的临床妊娠率差异亦无统计学意义。同样，供卵周期中在孕激素暴露的第3日、第4日或第5日后移植第3日胚胎，着床率、妊娠率和继续妊娠率差异亦无统计学意义［46］。
然而，虽然上述研究显示允许胚胎植入的种植窗口较宽，但过短的孕激素暴露会增加流产率。当移植前给予孕激素的时间短于胚胎日龄时（于孕激素暴露的第3日移植第4日胚胎），发生早期流产的风险显著增加［44］。而延迟移植（在补充孕酮的第5日移植第3日胚胎）会导致生化妊娠率明显升高［46］。
因此，除非有组织学或分子生物学证据证明个体种植窗口发生了改变，否则胚胎移植应遵循胚胎日龄 1 d方案或胚胎日龄 0 d方案。对多数人来说，遵循上述规律可以获得较满意的治疗结局。少数个体对孕激素的反应存在差异，对这些人采用个体化治疗可能是有益的。Gomaa等［47］在HRT-FET前根据子宫内膜组织学变化调整孕激素暴露时间，显著提高了着床率。
2. HRT-FET周期胚胎移植日血清孕激素浓度与治疗结局有无关系：
在自然周期的黄体期，由于LH的脉冲分泌，血清孕激素水平是波动的［48］，因此单次测定血清孕激素水平不能很好地反映黄体支持是否足够，也无法根据一次孕激素测定的结果预测妊娠结局。但在HRT周期，由于体内没有黄体，血清孕激素浓度通常很稳定。阴道给予孕激素后，血中孕激素水平在24 h内达到稳态，肌内注射黄体酮48 h血中孕激素水平达到稳态［49-50］。因此，HRT周期血清孕酮浓度可以很好地反映外源性孕激素吸收的状况，可能成为优化HRT-FET结局的切入点。事实上，已有很多研究显示HRT-FET周期胚胎移植日血清孕激素水平与活产率和持续妊娠率密切相关［29-31，51-56］。
早期研究显示，肌内注射孕激素，血清孕酮水平是阴道给药的6~7倍；而阴道给予孕激素时，孕激素主要被子宫内膜组织吸收，只有小部分到达体循环，子宫内膜孕激素含量是肌内给药的10倍［57］，即所谓的子宫首过效应。这种子宫首过效应似乎提示阴道给予孕激素时，血清孕酮水平可能与妊娠结局不相关。然而越来越多的证据显示，无论孕激素的给药途径如何，血清孕酮水平都与HRT-FET的治疗结局相关，血清孕酮水平是独立的影响预后的因素［29，53，58］。但使用不同剂型的孕激素，预测妊娠结局的血清孕激素cut-off值不同。
每日肌内注射黄体酮50~100 mg，移植日预测持续妊娠率和活产率的血清孕激素cut-off值为20 μg/L［30，52］。Boynukalin等［30］移植第5日囊胚，当移植日血清孕激素水平<20.6 μg/L时，持续妊娠率和流产率分别为41.8%和15.2%，而当血清孕激素水平≥20.6 μg/L时，持续妊娠率为70.3%，流产率为5.3%，多元回归分析显示移植当日的血清孕激素水平是持续妊娠的独立预后因素。同样，Brady等［52］在孕激素暴露的第4日移植第3日胚胎，当移植日孕酮水平<20 μg/L时，临床妊娠率和活产率分别为56%和50.7%，显著低于孕酮水平≥20 μg/L组的临床妊娠率和活产率（分别为73.4%和64.9%）。
两项前瞻性研究［31，55］和两项回顾性研究［32，53］对应用阴道微粉化孕激素者胚胎移植日血清孕激素水平与妊娠结局的关系进行了分析，结果显示移植日血清孕酮水平<9.2 μg/L时持续妊娠率显著下降［31］；获得最佳持续妊娠率的最低孕酮阈值为10 μg/L［32，53］；预测持续妊娠的血清孕酮cut-off值为11.0 μg/L，当孕酮水平<11.0 μg/L时持续妊娠率为35.3％，孕酮水平≥11.0 μg/L时持续妊娠率为55.6％［31，55］。而预测活产的血清孕酮阈值为13.5 μg/L，ROC曲线下面积为0.62（95% CI=0.53~0.72；P=0.01），敏感度为44.1%，特异度为79.2%［53］。Yovich等［29］在孕酮给药的第8~9日测定孕酮水平（每日阴道施用1200 mg孕激素），当血清孕激素水平<15.7 μg/L时，妊娠率明显降低。
阴道微粉化孕激素进入阴道后会迅速崩解，从而被快速吸收，比凝胶更快地达到稳态［59］。阴道凝胶在重复给药后会在阴道中积聚并缓慢释放孕酮。应用阴道凝胶时，血清孕酮水平是否与妊娠结局相关？2018年来自丹麦的一项研究显示，在HRT周期每日应用3支90 mg凝胶（Crinone 8%，每8 h 1支），当移植后9 d或11 d血清孕酮<11 μg/L时，持续妊娠率显著下降［60］。
上述研究显示，孕酮水平低下可以导致黄体期支持不足，从而影响胚胎着床，增加早期流产率，但也有研究显示，当孕酮水平过高时，也会对妊娠结局产生不良影响。Yovich等［29］应用阴道微粉化孕激素，当血清孕激素水平≥31.4 μg/L时，妊娠率明显降低。Kofinas等［58］报道肌内注射黄体酮，移植日孕酮水平>20 μg/L时，流产率明显增加，移植日孕酮突破40 μg/L时，持续妊娠率/活产率显著下降。作者推测孕酮浓度过高则可能会加速子宫内膜的发育，导致与胚胎发育不同步。此外，超生理水平的孕激素可能引起子宫内膜容受性相关基因的异常表达［61］。
根据上述研究，HRT周期胚胎移植当日的血清孕激素水平是影响妊娠率和活产率的独立预后因素，胚胎移植当日血清黄体酮水平过低会损害人工周期的妊娠结局。肌内注射黄体酮，最佳孕酮阈值为20 μg/L；使用阴道孕激素时，血清孕酮浓度接近15 μg/L，与更高的成功率相关。仍需要大样本、前瞻性研究来探索关于理想的血清孕酮水平，以优化HRT-FET周期的成功率和产科结局。
3. 影响血清孕激素水平的因素：
不同个体使用相同剂量的孕激素，血清孕激素水平存在很大的差异。例如，每日肌内注射黄体酮50~100 mg，32.8％的周期血清孕酮水平<20 μg/L［52］；每日阴道给予600 mg微粒化孕酮，37%的周期血清孕激素水平<10 μg/L［53］；每日阴道给予800 mg微粒化孕酮，25%的患者血清孕激素水平<9.7 μg/L［31］；应用阴道孕激素1200 mg/d，血清孕酮水平波动在8.5 μg/L到155.2 μg/L之间［29］。
研究显示很多因素影响了孕激素的吸收。体质量指数［52］、阴道黏膜或阴道的总表面积［50，62］、性交［63］都会影响孕激素的吸收。因此，在给予孕激素时，应该根据患者的具体情况个体化用药，并给出建议，避免影响药物吸收的生活方式。
4. 纠正黄体支持不足可以改善HRT-FET周期的结局：
由于HRT周期中个体间血清孕激素水平存在很大差异，因此有必要监测HRT-FET周期的血清孕激素水平，以便在移植当日孕酮水平不足的情况下优化黄体支持，改善妊娠结局。
在Labarta等［56］对1642例患者的研究中，如果移植日血清孕激素<9.2 μg/L，则在应用阴道孕激素的同时添加皮下注射孕激素，持续妊娠率得到显著改善，与移植日血清孕激素≥9.2 μg/L者相同。Alsbjerg等［64］虽然没有测定移植日血清孕激素水平，但作者发现在HRT-FET周期将Crinone 8%凝胶的剂量从90 mg/d（qd）增加到180 mg/d（90 mg，bid），可显著降低早期流产率，明显改善了临床妊娠率和活产率，因此该中心已经摒弃每日给予1支凝胶的方法。目前多数中心每日应用2支Crinone 8%凝胶［17，65］，甚至有中心每日应用3支Crinone 8%凝胶［60］。
此外，有学者在给予孕激素的第2日常规测定血清孕激素水平，如果低于相应阈值，则增加孕激素剂量，并将胚胎移植时间延迟24 h，成功率与高于阈值者相似［55］。
妊娠7~10周是黄体-胎盘功能转换期，到妊娠10周胎盘功能基本完善［66-67］，因此多数中心都选择继续应用雌孕激素直至妊娠10~12周［18，31，44，68］。
孕激素对妊娠的维持极为重要，但在妊娠初期雌激素并非必不可少［69］。自然周期排卵时雌激素峰值可达300~400 ng/L，排卵后急剧下降［70］，但HRT-FET周期血清雌激素可以一直维持在较高水平。已知口服大剂量雌激素可能增加血栓形成的风险［71］。
另外，IVF周期中过高的雌激素水平与不良妊娠结局（包括先兆子痫和子宫内生长受限）相关［72-73］。那么，HRT-FET妊娠后是否可以减少雌激素用量、降低雌激素暴露时间而不影响妊娠结局？最近，Zhao等［74］首次通过大样本回顾性分析报道，HRT-FET周期hCG阳性者（移植后12 d测定hCG）于移植后32 d停用雌激素或移植后2个月停用雌激素，两组的临床妊娠率和流产率差异均无统计学意义。有些中心在B超看到胎心搏动后即停用雌激素，但维持孕激素的使用直至孕10周［17，30，65］。
综上所述，第一，目前多数研究显示，HRT-FET周期血清雌激素水平与妊娠结局不相关，但无论是肌内注射还是阴道给予孕激素，胚胎移植日血清孕激素水平都是预测妊娠结局的独立因素。由于很多因素影响了孕激素的吸收，导致个体间血清孕激素水平存在较大的差异，因此在HRT-FET周期，当孕激素达到稳定状态后，测定血清孕激素水平，有助于发现潜在的黄体支持缺陷。不同中心应该确定各自的预测妊娠结局的孕激素cut-off值，以便指导临床医生及时纠正黄体支持不足，优化治疗结局。
第二，虽然血清雌激素水平不能预测HRT-FET周期的妊娠率及活产率，但鉴于雌激素的不良反应，孕激素转化日测定血清雌激素水平还是有意义的，给予孕激素后，可以适当降低雌激素使用剂量，使血清雌激素接近生理水平，可能优化HRT-FET周期的产科结局，对此还需要进一步的研究。
第三，过短时间的雌、孕激素暴露可能增加早期流产的风险。第四，HRT-FET周期妊娠后，及时降低雌激素剂量、缩短雌激素暴露时间，不会影响FET成功率。最后，目前多数关于HRT-FET周期雌、孕激素水平及暴露时间对妊娠结局影响的研究都存在样本量小的问题，ROC曲线下面积只有0.62，所选择的预测持续妊娠或活产的cut-off值的预测准确度和特异度欠佳。因此，应该进行大样本、前瞻性、随机对照研究，探索最佳的预测着床、持续妊娠和活产的血清雌、孕激素浓度和最适宜的暴露时间，提高成功率，降低不良反应的发生率，改善HRT-FET的治疗结局。
参考文献略
作者：李红真
本文刊登于《中华生殖与避孕杂志》2021, 41(3): 257-263.