PCR检测的常见问题及解决办法

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今天小编将和小伙伴们聊一聊PCR实验出现假阳性、假阴性的原因，以及在实验过程中的常见问题和相应解决办法。

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。

首先，我们要明确PCR反应的关键环节有：

①模板核酸的制备；

②引物的质量与特异性；

③酶的质量与特异性；

④PCR循环条件。

而寻找问题的原因亦应针对上述环节进行分析研究。

注PCR产物的电泳检测时间，一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。

问

假阴性，不出现扩增条带，正对照有条带，样品无条带?

答

可能原因及解决方法：

1.模板：①模板中含有杂蛋白质；

②模板中含有Taq酶抑制剂；

③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白；

④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚；

⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

2.引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增。

3.酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

4.Mg²⁺浓度：Mg²⁺离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

5.反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul，或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

6.物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水浴锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。

7.靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

解决办法：

1.纯化模板并重新提取，并检测模板是否含有抑制剂；

2.引物：①选定一个好的引物合成单位；

②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。

③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。

④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等；

3.优化 buffer，摸索镁离子浓度或适当加入 DMSO（小于 0.3%）；

4.提高退火温度，增加延伸时间。

问

假阳性，空白对照出现条带？

答

可能原因及解决办法：

1.引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。

2.靶序列或扩增产物的交叉污染，这种污染有两种原因：

①整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决，操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。

②空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

解决方法：

1.实验仪器高压灭菌；

2.实验试剂（酶除外）高压灭菌，离心管枪头一次性使用；

3.规范实验操作；

4.假阳性可通过巢式 PCR 解决，或者使用特异性较高的试剂盒扩增。

问

出现非特异性扩增带，PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带？

答

可能原因及解决办法：

1.引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。

2.Mg²⁺离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。

3.酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。

解决方法：

1.必要时重新设计引物；

2.减低酶量或调换另一来源的酶；

3.降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数；

4.适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。

问

拖尾、弥散，PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带？

答

可能原因及解决办法：

1.酶量过多或酶的质量差；

2.dNTP浓度过高，Mg²⁺浓度过高；

3.退火温度过低，循环次数过多。

解决方法：

1.减少用酶量或使用特异性高的热启动酶扩增；

2.减少dNTP的浓度，适当降低Mg²⁺浓度；

3.增加模板量，减少循环次数。

问

cDNA产量的很低？

答

可能的原因及解决办法：

1.RNA模板质量低；

2.对mRNA浓度估计过高；

3.反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足；

4.同位素磷32过期；

5.反应体积过大，不应超过50μl。

问

产生弥散（smear）条带？

答

可能的原因及解决办法：

1.在PCR反应体系中第一链产物的含量过高；

2.减少引物的用量；

3.优化PCR反应条件/减少PCR的循环次数；

4.在用DNase处理被DNA污染的RNA样品时，其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增，一般会显示为弥散背景。

问

产生大分子量的弥散条带？

答

可能的原因及解决办法：

1.大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特异性的起始及延伸产生的；

2.对于长片段的PCR，建议将反应体系中cDNA的浓度稀释至1:10（或1:100-1:200）。

问

在无反转录酶的情况下，对照RNA获得扩增结果？

答

可能的原因及解决办法：

1.通常是由于对照RNA中含有痕量DNA而导致的。由于进行体外转录时不可能将所有的DNA模板消除。建议可将第一链cDNA稀释1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影响；

2.有可能是引物二聚体的条带。

问

扩增产物滞留在加样孔中？

答

可能的原因及解决办法：

1.有可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物，建议将第一链结果至少稀释100倍再进行二次扩增；

2.另外，在二次PCR时使用的退火温度如果比引物的Tm值低5℃，可以将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性。

问

为什么得不到RACE产物？

答

可能的原因及解决办法：

1.加入Hela对照；

2.低质量的RNA模板；

3.逆转录失败，SSII和SSIII非常适用于长模板cDNA的合成；

4.目的基因丰度太低，可以通过提高PCR的循环次数来解决，建议使用巢式PCR；

5.目的基因没有表达，可以通过使用两条GSPs来分析cDNA中是否含有目的基因；

6.目的基因太长而不适合进行反转录，建议使用GeneRacer试剂盒中的Oligo dT来得到全长cDNA，使用随机引物或与模板的5’端尽可能近的GSP进行PCR；

7.cDNA模板属于困难模板，可以通过以下方法解决：优化PCR反应参数及反应体系；降低退火温度；使用5-10％的DMSO帮助通过高GC含量区；使用高保真度和高延伸能力的酶进行PCR反应。

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