双酶切和同源重组法构建载体

基因克隆是分子生物学中的一种基本的操作方法。通过双酶切来构建载体是其中常用的一种方法，这种方法利用限制性内切酶可以识别并切割特定的核苷酸的原理，用两种不同的限制性内切酶切割靶基因得到前后都带有粘性末端的靶基因片段，与同样经两种限制性内切酶切割得到的带有相同粘性末端的线性载体在T4 DNA连接酶作用下进行连接，从而实现基因克隆。但是在实际操作中经常会遇到酶切效率及连接效率不高等问题，致使靶基因片段插入载体相当困难，为此人们采取了多种策略进行克隆。最近开发了一种叫做同源重组的基因克隆方法， 相比双酶切载体构建方法，该方法的构建过程有些不同。首先，靶基因片段扩增引物有别于常规引物设计；其次，载体切割过程中只需要进行单酶切；第三，载体和目的基因片段的连接是基于同源重组而不是粘性末端互补。

载体构建是分子生物研究常用的手段之一，整个过程包括目的基因扩增，载体和目的基因酶切，末端间连接，感受态细胞转化和阳性克隆的筛选，每一个步骤都必须严格控制其反应条件。

一、双酶切构建载体方法

双酶切构建载体方法比较繁琐。

首先，对引物的设计有着严格的要求，引物的长度一般为18-25bp，GC含量控制在40%-60%，上、下游引物之间GC含量不能相差太大，引物中需要加入酶切位点及保护性碱基。引物设计不当可能在扩增时生成引物二聚体，给实验带来不便。

其次，目的基因有必要进行TA克隆。在后续的实验操作中，可能会由于酶切效率和连接效率低等原因使得载体构建相当困难，目的基因扩增在这些步骤之前，由于PCR扩增是体外扩增，很容易发生突变，TA克隆有着成功率高的优点，通过TA克隆将目的基因构建进pMD 19T进而转化入大肠杆菌中，单克隆菌体自身的修复机制可保证单一的克隆，利于筛选需要的序列，通过后续测序鉴定可以得到大量正确的目的基因片段，而且直接将PCR产物切下来不易产生粘性末端，连接入表达载体比较困难，通过TA克隆酶切的目的片段产生粘性末端的概率很高。

第三，双酶切效率不高。由于不同的酶所对应的缓冲液不同，内切酶只有在最适的缓冲液环境下效率才能得到最优化，但是双酶切体系势必使其中一个酶的活性有所损失。这样必定会使酶切产物不纯。酶切产物中既有单酶切线性载体，也有双酶切线性载体，使得连接时所需要的双酶切线性载体的量失准，影响连接效率。因此可以先用一个限制性内切酶切割纯化回收，但工作量较大，回收率低。

第四，连接效率低。pMIR reporter与目的片段的摩尔比很重要，一般在3:1-10:1间浮动，而且连接效率和连接反应体积也有关系。

二、同源重组法构建载体

采用同源重组法构建载体与常规双酶切构建载体方法不同。

首先，设计引物时上游引物5’端前面加的是酶切位点（如Hind III）及该酶切位点在pMIR reporter载体中对应前面的15个碱基载体片段，下游引物5’端前面加的是Hind III酶切位点及该酶切位点在pMIR reporter载体中对应后面的15个碱基载体片段，如此设计引物是为了保证目的片段插入载体时方向正确。

其次，载体只需要单酶切，用Hind III酶切pMIR reporter，使得pMIR reporter成为两端都带着Hind III位点的线性载体。相比双酶切切割载体，单酶切可以保证酶切后的载体都是单一的线性片段，使得后续的重组连接更准确。

第三，省去了TA克隆环节。因为PCR产物可以直接用于重组连接，不需要酶切产生粘性末端，而且重组酶的重组能力强于T4 DNA连接酶的连接能力，一般只需要一步即可重组连接成功，因此可以在重组反应之后进行测序鉴定。

总之，两种方法各有利弊，双酶切构建过程比较繁琐，同源重组构建过程相对简单，可以省去很多的时间和精力，但假阳性率略高。