编译：微科盟傻狍子，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。
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导读
从昆虫到哺乳动物，各种各样的动物肠道中拥有复杂的细菌群落，这些细菌在维持健康和控制疾病中起着重要的作用。为了进一步了解肠道细菌群落的组装和功能，本实验采用自下而上的方法研究线虫肠道的微生物，将这种线虫与细菌单培养物、两种至八种细菌的混合物一起喂食。结果表明，由于细菌种间相互作用，在细菌单培养物中定殖良好的细菌在混合培养物中表现并不良好。而且，随着微生物物种多样性的增加，种间相互作用对微生物组装更为重要。为了探索宿主-微生物适应性，本研究比较了从C. elegans和非天然分离物中分离出的细菌，发现细菌的定殖能力更多的是由物种的分类决定的，而不是分离的起源决定的。最后，通过比较两个C. elegans线虫肠突变体中的组装菌群，我们发现通过p38 MAPK途径产生的先天免疫力降低了细菌丰度，但对菌群组成影响很小。这些结果表明，细菌种间相互作用比宿主-微生物适应或肠道环境过滤更重要，在C. elegans线虫肠菌群的组装中起主要作用。
原名：Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C.elegans intestine
译名：细菌种间竞争调节C. elegans线虫肠中的群落的组装
期刊：The ISME Journal
IF：9.180
发表时间：2021.2.15
通讯作者：Nicole M. Vega &Jeff Gore
通讯作者单位：美国麻省理工学院物理系
这项实验主要使用线虫 C. elegans strains N2（野生型），AU37和SS104。非天然细菌获取来自ATCC：Bacillus subtilis（Bs），Enterobacteraerogenes（ATCC 13048）（Ea），Lactobacillusplantarum（ATCC 8014）（Lp），Pseudomonaschlororaphis subsp.aurantiaca（Pa），Pseudomonascitronellolis（Pc），Pseudomonas fluorescens（Pf），Pseudomonas putida（Pp），Pseudomonasveronii（Pv）和Serratia marcescens（Sm）。大肠杆菌MC4100（Ec）从大肠杆菌遗传资源中心获得。将C.elegans N2在个别类型的腐熟有机物(苹果、芹菜、杏仁和香菜)上生长1周，然后将虫子外部清洗消毒，磨碎虫子，将所得的菌悬液镀在琼脂平板上，分离出C.elegans N2原生的微生物菌株。通过16S Sanger测序分析物种。为了构建培养物来喂养线虫C. elegans，细菌菌株生长至饱和状态，根据CFU计数，将细菌培养物标准化为108 CFU/ml。将无胚芽的成年蠕虫重悬于1％AXN中，使其浓度达到1000蠕虫/mL。将120 µL（约100个线虫）的等分试样转移至96深孔培养板（1 mL孔体积，Eppendorf）中。在所有喂养实验中，添加细菌悬浮液使每个细菌菌株的浓度达到107CFU/ml。将平板用Breathe-Easy（Sigma-Aldrich）密封膜覆盖，并在25°C下摇动孵育4天。每天清洗线虫样品，并补充细菌。添加500 µl M9 缓冲液 + 0.1％v/v Triton X-100（Tx），用液体处理器（VIAFLO 96，Integra）洗涤样品，移液10次，并在线虫沉淀后除去上清液。将线虫转移到新的96个深孔板中，以留下生物膜，然后以相同的方式用1％AXN洗涤两次。如前所述添加新鲜细菌培养物，清洗线虫样品以去除大多数外部细菌，然后在25°C的100 µL S培养基+ 2X热灭活的OP50中孵育1 h，以使线虫从肠中排出所有未粘附的细菌细胞。然后将线虫用M9缓冲液冲洗两次，在4°C下冷却15分钟以停止蠕动，并在100°C下用100 µL M9 缓冲液+ 0.2％v/v漂白剂（Clorox）漂白6分钟。然后用冷的M9缓冲液+ 0.1％Tx将线虫冲洗3次，以除去漂白剂。遵循先前描述的方案，用电动杵手动打碎，用碳化硅砂砾打碎96深孔板。为确保背景培养基完全干净，还收集每个样品的上清液，进行连续稀释，然后铺在营养琼脂上。将平板在室温下孵育2天，以使菌落形态发生明显变化，然后借助立体显微镜对菌落进行计数。使用相同的1％AXN培养基，96个深孔培养板，每个样品用于定殖线虫的样品体积为150 µl，以105 CFU/ml的浓度混合细菌对这种接种物的浓度低于线虫定殖实验中的浓度。并允许细菌相对丰度可通过七个生长-稀释周期进行平衡，每天将细菌稀释100倍至新鲜培养基中。通过接种到琼脂培养基中并区分菌落形态来定量细菌丰度。通过在成对和单培养的CFU/线虫数据上同时进行分析（置换抽样）来计算共培养中某物种的平均相对产量RYi|j，并分别获得向量Ni|j和Ni。
1. 单一培养物在C. elegans线虫肠道中定殖的能力差异很大为了调查C. elegans线虫肠道内的群落组装，将无胚芽的同步成虫与不同的细菌物种以单种或混合的方式在丰富液体培养基中喂养了4天。大多数线虫在饲养和定殖中都存活，让活的线虫在热灭活的大肠杆菌E. coli OP50上短暂觅食，以去除瞬时定殖者。然后使用连续的清洗液清洁线虫的表面，并通过研磨一批线虫，铺板并计算具有不同形态的菌落形成单位来测量肠道细菌的密度。通过线虫消化后的培养基上清液进行CFU计数。该方法使我们能够构建C. elegans线虫中的简单菌群。我们从在单一培养物中饲喂C. elegans线虫开始，以量化一系列细菌物种在线虫肠道中定殖和生长的能力。首先，我们利用免疫功能低下的C. elegans线虫突变体（AU37）和一组11种非天然细菌物种（图1B），我们发现，所有细菌物种都可以在线虫小肠内定殖（即在有或没有活跃生长的情况下积累），其平均种群大小从蜡样芽孢杆菌中的200 CFU/条，到粘质芽孢杆菌中的20000 CFU/条。三个厚壁菌在线虫肠中数量较少，在液体介质中的承载能力较低，但是液体培养基中的携带能力不能解释单培养定殖的变化。这些结果表明，不同的非天然细菌物种在本体培养中都具有定殖线虫肠的能力。
图1 不同的细菌物种在C.elegans肠道中达到的种群规模大不相同。A C. elegans线虫肠微生物菌群装配图和影响该过程的三种生物力（橙色），我们将在本文中进行研究。为了在C. elegans线虫中构建和测量简单的微生物菌群，将一定数量的细菌物种通过液体培养喂入事先用抗生素灭菌的同龄线虫种群。每天恢复供液的底物，以在定殖的4天中保持相等的细菌浓度。之后，将线虫以约20个批次进行机械破坏，并使用菌落形成单位（CFU）的数量来确定线虫肠道中的细菌种群的数量。B来自11种非本地细菌物种的全长16S rRNA基因序列的系统发育树，用于定殖线虫的肠道。CC. elegans线虫（AU37）突变体的单培养物定殖中的细菌种群大小。这些种群大小反映了细菌在线虫肠道环境中定殖的能力。点是八个或更多生物重复的平均值，误差线是平均值的标准误差。2. 两种微生物群落的组成受竞争性和等级性细菌种间相互作用的影响为了评估C. elegans肠道中微生物群的组成趋势，我们对线虫进行喂食，主要是来自十一种非天然细菌的所有可能的两种物种混合物，构建了该线虫肠中最简单的细菌群落。用两种浓度相似（107 CFU/ml）的细菌喂养线虫，以使摄入速率正常化。我们发现，大多数配对（55个中的41个，约75％）显示共存，两种物种都超过2％的检出限，而其余物种（55个中的14个，25％）导致竞争排斥（图2B）。这些结果表明，C. elegans线虫肠道中细菌通常会在两种生物群落中共存。基于细菌相对于其单培养物中种群规模的产量，微生物种群中物种之间的相互作用可分为阳性，阴性或中性。为了对两种微生物群落中的相互作用进行分类，我们计算了物种“i”与物种“j”的相对产量RYi|j，其在共培养中的种群数量Ni|j除以其在单培养中的种群数量。我们发现在共培养实验中，大多数物种都无法达到其单培养种群数量，RY<1，表明物种之间的相互作用在具有竞争性。根据我们的110个RY测量值，只有与Pa共培养的Ea的RY显著大于1。此外，大多数共培养的群落数量都比其在单培养种群数量低，表明观察到的相对产量较低不仅仅是由于线虫肠道中固定空间的竞争所致。有趣的是，每个物种的平均相对产量与其单培养定殖不相关，表明在共培养实验种群数量大并不能保护细菌免受竞争的伤害。为了探索不依赖于物种间相互作用的单培养定殖能力对线虫肠中微生物群落的影响，我们进一步比较了单菌种群两种微生物群落的大小。我们首先通过计算所有两个物种的微生物群中每个物种的平均分数丰度，将结果简化为一个摘要度量，即
，我们发现，平均分数丰度与单一培养定殖中达到的种群规模呈正相关（图2D，rs=0.86，p<10–3）。这种正相关关系表明，由于一种细菌的特性与肠道中单菌落定殖的特性相似，因此它们在两个物种的微生物群落中仍然存在。这与先前的结果一致，即竞争造成的不均衡损害并不会显著改变单一培养预期的平均分数丰度。因此，我们研究微生物之间的相互作用对宿主中的成对结果。假设每种物种都能达到单培养定殖中测得的承载能力，我们对两种物种的微生物群计算了零期望值（图2A）。对成对定殖获得的实验测量组分进行比较，我们能够确定物种间相互作用在肠道菌群组成中起主要作用。在55个案例中的28个案例中，该偏差足以拒绝无效模型（p<0.05，图2A），远远超过在此显著性水平上偶然预期的2.75个案例（16个案例，PFDR<0.05）。这些结果表明，每个物种成对定殖的能力是由其对线虫肠道环境的单培养适应性决定的，而不是由细菌之间的相互作用决定的，因此无法预测两个物种的微生物种群。
为了进一步描述竞争网络的结构，我们量化了其竞争等级，它估算了排名较强的竞争者在较低级别的竞争者中占主导地位的频率。该网络的等级得分为0.82，大大高于分数丰度分布相同的随机矩阵中的等级得分（p<10-5），这表明竞争能力排序为线虫肠道中的这些细菌种类。与此顺序一致，我们没有观察到任何不竞争的情况，在这种情况下，三种细菌物种的成对相互作用将类似于石头剪刀布的游戏，并且绝对不存在赢家。但是我们在165组假想的三种细菌中的任何一个成对交互中都没有观察到它。通过对不及物性进行更宽松的定义，即一个物种比竞争者更加丰富而不是需要完全排除它来赢得了竞争，我们找到了两个具有剪刀石头布状结构的候选组合微生物种类：Ec-Pf-Pa和Pp-Pf-Pa。总的来说，我们发现细菌的单培养定殖能力与其在两种物种的微生物群落中的平均丰度相关。此外，种间相互作用（主要是竞争性和等级性）改变了至少两种个体微生物群落组成。
图2 线虫肠道的单培物定殖常常无法预测两种物种的微生物群的组成。A 左图：线虫小肠（AU37）中55个共培养实验的分数丰度；误差线是标准误。细菌物种在所有共培养物中的平均分数从左到右排序。右图：基于非相互作用模型的分数丰度的空值预期，在该模型中，每个细菌物种在单一培养中均达到其种群大小；误差线是标准误。从引导单一文化数据。*和**分别代表两个面板在p值为0.05和0.01时的统计学显著性差异（Welch T检验）。B 在线虫肠道中，两种物种的共存比竞争性排斥更为普遍。C 与单一栽培相比，两种微生物菌群的单产低，表明竞争相互作用（图S2）；X轴上的误差线为标准误。在Y轴上为同时为单培养和成对数据。D 竞争能力，定义为共培养实验中的平均分数丰度，与单养种群数量有关，但存在显著差异；Y轴上的误差线是来自共培养实验误差。3. 通过成对实验而不是单培养实验来预测的三种物种微生物群落的丰度在两种微生物群落中，我们观察到C. elegans肠道中非天然细菌共存现象，但这种共存是否也是在肠道中大量物种初始化的常态还有待检验。因此，我们在线虫中构建了20个3种微生物群落，以进行进一步分析。从我们的11种非天然细菌物种中，我们选择了一组6种微生物(Bc、Lp、Pf、Pv、Ea和Sm)，它们跨越了观察到的竞争能力范围，将它们以所有可能的三元组合喂食给线虫。举例而言，在E. aerogenes-P.fluorescens-S.marcescens中，我们观察到3种物种共存，其中Ea占多数，Sm次之，Pf占少数(分别为55±7%、42±5%、3±3%)。这些丰度可以用一堆条形图(图3A)表示，也可以用单一图中的一个点表示(图3B)，当某种物种的丰度增加时，这个点会向一个顶点移动。通过将所有20个三元组的测量值绘制成一个单形(图3C)，实验的大多数情况都存在高度丰富的一种物种，但很少被完全排除的物种，仅占20个测试的中的3个(图3D)。因此，三种微生物喂养线虫实验显示了一系列不同的结果，三种微生物的频繁共存导致了多种肠道微生物的出现。
图3 通过成对实验可以很好地预测三种物种的微生物群落的分数丰度。A C.elegans（AU37）肠道中Ea-Pf-Sm的结果，以及基于单培养种群规模两种生物群落或成对体外液体培养基成对结果的预测。B（A）中三元组合和预测的单形表示，三角形的边缘描绘了C.elegans线虫肠中两种物种的微生物群。四个生物学重复样本中，周围的点是400个重复样本（“N”采样为单培养数据，“W”和“M”分别采样线虫和培养基中的成对数据）。C 20个三元组合结果以1/6的单形表示。D 3,8和9在20个三元组合中分别表现为完全竞争排斥，两种和三种共存。E 当其中一对是竞争排斥时，组装规则有助于成对结果的三种物种的定量预测。F 预测误差的累积分布。误差计算为单形中预测和测量之间的线性距离。距离用最大距离√2归一化。虚线是测量的平均值和每个三组的四个生物重复之间的平均距离，并作为预测误差的下限。为了检验单培养定殖是否包含估计三种微生物群落组合的必要信息，我们在单培养的基础上对三种结果进行了定量预测。我们假设所有物种都将在单培养中达到它们的种群规模。这种无效期望值在预测三种结果时效果较差，其平均误差为35.7%，略好于“1/3，1/3，1/3”预测的43.8%的平均误差(图3F)。因此，单培养无法预测三种微生物群落，这突出表明，随着群落多样性的增加，单培养的肠道定殖特性在确定群落组成方面不如种间相互作用重要。为了确定细菌的相互作用对线虫肠中菌群组合的影响，我们在两种菌群的基础上对线虫菌群的三种菌群进行了预测。然而，当两种微生物群中的一种是竞争排斥时，这种预测容易出错。最近提出的组装规则是能够在无法同时在两个组分的共培养实验中存活下来的情况下，简单地从三重预测中删除细菌种类来调整这些情况。应用此集合规则后，基于两种微生物的预测平均误差为18.7%，接近于三种微生物的预期生物误差13.3%(图3F)。通过两个物种的微生物群落可以正确预测三个微生物群落，事实表明，细菌之间的相互作用是决定微生物群落装配的重要原因。接下来，我们探讨了是否有可能根据不同环境（例如用作进料底物的体外液体培养基）的成对结果对20种三个微生物群落做出预测。因此，我们在无线虫的液体培养基中进行了所有可能的成对共培养实验，并在每天100倍稀释7个循环后测定了细菌。应用组装规则后，基于培养基成对结果的预测的平均误差为15.7％，也接近三种物种微生物群的预期生物误差（图3F）。由于液体培养基中的平衡分数丰度取决于稀释方案，因此我们的结果表明，我们选择的每日100倍稀释可以类似于线虫肠道中的成对结果。这些结果表明，在不同的环境下，线虫体内三种细菌的群落结构仍然可以进行预测，说明线虫肠道的环境过滤并不是其群落组成的主要决定因素。4. 细菌在C. elegans肠道微生物群中的相对丰度取决于系统发育，并非是分离的来源到目前为止本实验已经探索了线虫肠道微生物群与非原生细菌的组合(图1B)。这些微生物物种不是从任何线虫的肠道中分离出来的，在我们的每个实验开始之前，它们也没有在线虫的肠道环境中培养。使用这些非原生细菌可以降低与微生物群组装相关的复杂性。在非本地物种中观察到强的和弱的竞争者，由于物种间的相互作用，这些观察结果是否适用于C. elegans肠道中的细菌还有待观察。先前的研究通过在腐熟的有机物中分离和培养线虫来评估天然的线虫菌群，并通过研磨天然定殖的线虫来分离天然的细菌菌株。本实验用类似的方法从线虫中分离出新的细菌菌株，也利用了Dirksen等人[1]的MYb收集方法。其中包含一些长期在线虫肠道中发现的细菌。从这两个样本中，选择了一组跨越四种不同门的系统发育不同的细菌分离株，以研究天然细菌的定殖模式(图4A)。
图4 C. elegans在不同天然和非天然细菌中的实验定殖表明，系统发育而非分离起源决定了肠道菌群的丰度。A 先前研究的实验室物种（非本地）与线虫肠道分离的细菌菌株利用全长16S基因序列的比对，以最大估计建立的系统发生树。系统发育树在每个内部节点处排序，以在底部具有较高的单培养定殖者。为了便于解释，在树的左侧给出了高水平的系统发育分类。星号表示用于后续两种微生物群落的细菌。B 在野生型C. elegans（N2）的单培养定殖中细菌种群大小。C 左图：C. elegans（AU37）肠中带有天然和非天然细菌的两种物种微生物群落的分数丰度。右图：基于单一种群数量的分数丰度的空值预期。“*”和“**”分别表示p值分别为0.05和0.01时，测量值与零期望之间的统计学差异。D 尽管两个自然菌株可以在单培养中线虫肠道的定殖，但是这些菌株在两种微生物群落中的分数丰度较低。E 竞争能力的差异与系统发育距离相关，而与细菌的分离来源无关。系统发生距离是系统发生树中的水平距离。竞争能力的差异通过配对的最大竞争能力进行归一化。为了表征天然细菌分离株的单培养定殖能力，进一步将它们与8种先前的非天然细菌一起分别饲养到野生型C. elegans中。结果表明天然细菌和非天然细菌以相似的方式繁殖。无论分离物的来源如何，Fimicutes定殖都较差，Gammaproteobacteria则定殖的良好，导致某些情况下单培养种群的大小超过了10,000 CFU/线虫。通过比较每对细菌之间的16S系统发生相似性与其在单培养定殖中的倍数差异，观察到相似细菌的定殖相似，并且随着系统发生距离的增加，定殖能力的差异趋向性也增加，并且在芽孢杆菌属，微细菌属，鞘氨醇杆菌属，沙雷氏菌属，嗜铬杆菌属等都可以观察到（图4A，B）。总体而言，这些结果表明，原生和非原生细菌菌株的单培养定殖能力相似，表明该指标取决于进化历史而不是分离的来源。为了研究原生细菌与非原生细菌的竞争能力，对4个原生菌株和4个非原生物种进行单培养和成对组合培养(图4A)。在免疫缺陷AU37线虫中测量的物种丰度表明，两种微生物的组成再次偏离基于单培养定殖的零期望(图4C，p < 0.05)。在涉及原生细菌的新实验中，更多的相互作用似乎是阳性的(以寄生虫的形式)，其中最容易促进Ea，Sm和MYb10的相互作用。此外，还发现了非原生细菌比原生细菌具有更高的平均分数丰度(图4D)。Ochrobactrum MYb71和Achromobacter MYb9在单培养菌群规模最大，但在两种微生物群落中丰度较低，表明竞争能力较低，而MYb10相反，表明原生细菌也在线虫的消化道中相互作用，构建微生物群组成(图4C)。这些原生细菌与非原生细菌相比，缺乏明显的竞争优势(Ea, Sm;图4D)。为了测试系统发育差异是否导致了所观察到的竞争能力差异，使用一组原生细菌与非原生细菌比较了这两个指标(图4E)。结果表明，细菌的竞争能力随着细菌在系统发育上的分化（16S基因）差异更大，而与分离来源无关。在控制系统发育距离的情况下，线虫肠道的原生菌株与其它原生菌株或非原生菌株表现出同样的差异(图4E)。因此数据表明，线虫中两种生物群落的组成，更多地取决于物种的系统发育分类。为了进一步表征线虫肠道环境对细菌群落组装的影响，直接比较了体内肠道和体外液体培养基之间的55个共培养实验的结果（图5A）。发现线虫肠道和液体培养基的竞争能力（图5A）与平均相对产量相关，这表明线虫提供的环境过滤能力不足以改变这11种细菌菌株的分层排序。尽管线虫肠道和体外液体培养基之间的竞争能力相似，但55种细菌中19种细菌在这两种环境中显示出显著不同的结果。从这19对细菌中，有9种细菌在线虫中共存，但在液体培养基中出现竞争性排斥，这表明线虫肠道允许更多的共存群落。因此，线虫肠不会改变细菌定殖的竞争特性，但能够改变特定的共存群落。
图5 在体外和体内环境中，细菌的种间相互作用是相似的，但由于线虫肠道的酸性造成了一些差异。A 黑点是线虫肠道和液体培养基(1% AXN)共培养实验的平均丰度;误差条是基础共培养实验的s.e.m.误差。蓝点是在线虫和培养基上进行的单独共培养实验的结果。B 在一个耦合实验中，S. marcescens和P. putida在线虫肠道和体外液体培养基中达到了不同的丰度分数。C 体外成对培养加入线虫肠道内平均pH值(4.5)是酸性的结果与体内状态接近。为了研究线虫肠道和液体培养基的区别，本文开始研究这两种环境中的两个物种，即S. marcescens-P.putida。Sm在体外菌群中占少数(20±2%)，但在虫肠中占多数(76±12%，图5A)。首先用Sm-Pp混合物喂养一群线虫，但两种物种的比例不相等，而是允许细菌通过稀释步骤转移。在这个耦合的共培养实验中，线虫和培养基之间的细菌群落发生了强烈的迁移，可以观察到在不同环境中的群落存在不同组成状态(图5B)。该结果表明，由线虫肠施加的环境过滤作用可能很强，以使内部细菌群落与其周围环境保持不同。考虑到pH值对微生物生长和竞争的重要性，测试了线虫肠道的较低pH值是否会导致Sm-Pp细菌在不同环境中的差异。因此在正常pH值为6和较低pH值为4.5的液体培养基中重复了共培养实验，结果表明pH值为4.5更接近线虫肠道内的培养条件。结果表明，降低培养基的pH值足以改变在体外的实验结果，并培养出与线虫肠道中观察到的非常相似的群落(图5C)，在Lp-Bs中也发现了类似的结果。因此，线虫肠道的酸性pH值可能是线虫在群落装配过程中环境过滤的重要因素。6. C. elegans线虫的先天免疫减少细菌种群规模，但对微生物群组成影响不大为了进一步了解线虫通过其免疫系统组装菌群的作用，比较了一个微生物群在两个生态中不同免疫水平(图6)。C. elegans AU37由于其缺失sek-1基因而高度易受细菌定殖。线虫p38 MAPK途径激活免疫效应分子的产生，如溶菌酶lys-2和lys-8。C. elegans SS104与AU37发生glp-4突变，在室温下导致不育，因此，我们通过研究野生型sek-1基因，因此p38 MAPK途径可保持完整的信号传导的同生长阶段线虫。通过比较线虫菌株SS104和AU37的肠道菌群，可以直接研究线虫的p38先天免疫通路在肠道菌群中的作用。本文首先研究向线虫SS104喂食之前显示的11种非天然和4种天然细菌菌株单培养定殖。发现所有细菌物种都定居于SS104肠道，平均种群大小从Bs的30 CFU/线虫到Pa的10,000 CFU 线虫不等（图6A）。结果表明，具有p38免疫能力的线虫肠道细菌种群大小比免疫受损的AU37菌株低4倍，但是细菌载量减少在物种之间是不均匀的。例如，不管p38 MAPK途径的活性如何，Ea，Pa和AcinetobacterMYb10似乎都具有相似的携带能力，该途径活跃时，Bs，Pv和Achromobacter MYb9种群大小减少了90％以上。结果表明，线虫通过p38 MAPK途径的先天免疫系统减少了大多数细菌菌株的种群规模，但对某些寄生者的影响较小。
图6 线虫通过p38 MAPK途径的先天免疫减少了细菌数量，但对微生物群落的组成影响不大。A 线虫的免疫系统减少了不同细菌数量。免疫缺陷线虫(AU37)的肠道细菌数量大于免疫缺陷线虫(GLP4)。B 两种免疫活性不同的线虫品系在共培养条件下的平均丰度分数相似。C 免疫缺陷线虫AU37和免疫活性线虫SS104肠道微生物群的组成基于同一线虫菌株的单培养定殖和成对结果的预测。D 误差是测量复制和预测之间的L1范数(曼哈顿距离)。AU37和SS104在不同批次被消化的线虫之间的变化分别产生了9.3%和14.2%的测量误差。预测误差的置信区间是通过对相应数据进行bootstrap计算得到的。为了测试通过p38 MAPK线虫免疫系统对微生物群落组成的影响，将先前在免疫受损的AU37中研究过的所有细菌成对组合饲喂有免疫能力的SS104。结果表明，两种线虫突变体中菌株的平均分数丰度之间具有很强的相关性（图6B），其中Ea和Sm是最佳竞争者，而Bs和MYb27是两种线虫突变体中最差的竞争者。还观察到两种线虫菌株中大多数微生物群的丰度相似。结果表明，p38 MAPK途径的免疫对线虫的菌群组成几乎没有影响。进一步在两个线虫菌株AU37和SS104中利用同一组天然和非天然菌株（图4D）喂食4天后，测量了随后的微生物群中的细菌丰度（图6C）。两种线虫品系中三种最丰富的细菌种类是相同的：Ea，Sm和MYb10。根据两种菌群的结果，具有不同免疫水平的两种线虫显示出非常相似的平均菌群组成。这些结果表明，线虫通过其p38 MAPK途径的免疫力对富集度较高的微生物群的组成没有影响。进一步基于单培养和成对培养对八种微生物群落进行了预测（图6C，D）。和以前一样，首先假设每个物种都能够达到在单培养定殖过程中测得的承载能力，并计算出了零期望值。单一培养物的这一预测在免疫受损的AU37中达到70±5％的平均误差，在具有免疫能力的SS104中达到42±13％的平均误差。结果表明，关于单菌种定殖的信息不足以预测微生物群的组装，这凸显了种间相互作用的重要性。然后利用两个物种的微生物群来预测两个线虫中的八种微生物群落（图6C，D）。该预测在免疫受损的AU37中达到28±7％的误差，在具有免疫能力的GLP4中达到28±11％的误差，其误差小于单一培养的预测。结果表明成对菌落的相互作用在估算较大微生物群时是有用的。本实验中描述了线虫肠道的原生和非原生菌株的细菌定殖。通过在三种不同的环境中进行观察，发现所有细菌菌株产生了相似的竞争能力，这表明线虫肠及其免疫系统进行的环境过滤对细菌群落的组成影响不大。结果表明，细菌种间相互作用对2种、3种和8种微生物的组成有很大影响，而单培养定殖、细菌的分离来源、肠道的环境过滤和线虫的免疫系统在组装过程中起次要作用。结果表明，与实验室培养的菌株相比，从线虫肠道分离出的菌株不适合形成更大的种群或成为更好的竞争者。这种差异的可能性是，微生物的适应性对于分离出它们的确切宿主而言是受到限制的。结果显示E. aerogenes和S. marcescens是线虫肠道的最适细菌，这与以前的结果一致，即Enterobacteriaceae和Pseudomonadaceae是天然线虫中最丰富的细菌进化枝，表明Gammaproteobacteria擅长定殖在肠道内。本实验在微生物种群的预测中使用非原生细菌也留下了一个问题，即是否可以通过体外结果来预测具有原生物种的群落。最近的工作表明，原生细菌对于线虫可能具有重要的功能，并在该宿主中诱导特定的转录反应，为宿主选择的自然选择提供了依据。在微生物共同进化的群落中，体外和体内的群落组装可能会出现更大的差异，这似乎是合理的。结果表明，非原生物种之间的大多数成对相互作用是竞争性的，但是在具有原生物种的微生物群中出现了一些促进性相互作用。因此，进一步的研究应测试原生物种是否会进行相互促进作用。早期的研究表明肠道环境的低pH值是宿主-微生物相互作用的关键因素，最近的研究明确表明pH值在调节微生物之间的相互作用、决定合成和自然群落结构方面的重要性。与这些结果一致的是，本实验观察到通过降低液体培养基的pH值来模拟宿主肠道可以改变物种间的竞争结果，在某些情况下，还可以显著减少体外培养基和体内肠道之间的培养结果差异。在实验中，通过p38 MAPK在线虫SS104中激活的抗菌素防御，包括脂酶和皂苷类蛋白等，并没有实质性地改变微生物菌群的微生物组成，这与之前的结果一致。本文介绍的工作重点是种群平均水平，而不是单个线虫中细菌群落的组成。最新研究结果表明，当摄食密度低于本文使用的密度时，在线虫肠道的定殖过程中可能会出现极端的生长瓶颈，导致线虫之间的显著特异性，在果蝇中也发现了类似的结果，这表明定殖过程中的随机效应在许多宿主物种中可能很重要。在线虫种群的平均水平上，观察到的竞争排斥可能是资源竞争的结果，包括竞争线虫肠道内有限的空间，或者可能存在更明确的拮抗形式，例如毒素的产生。在细菌共存的情况下，宿主内的空间分配可能更为重要，例如最近在斑马鱼肠的单培养定殖中的发现证明了该看法。对于未来的研究而言，确定线虫中的多物种群落组装过程中随机性、优先效应和空间动态的作用将是非常重要的研究方向。在这项研究中，通过对线虫喂食了具有特定细菌种类的组合，以阐明种间相互作用在宿主相关微生物群落装配中的作用。这些结果加深了我们对成对细菌之间的相互作用将如何形成更复杂的细菌群落的理解。结果表明，微生物生态学是一种了解简单模拟生物中细菌肠道群落动态的工具，可用于深入了解微生物群的结构。
作者通过对线虫进行了特定细菌种类组合的喂食，来探讨线虫体内多细菌群落组装过程中起主要作用的因素。通过研究表明，细菌种间相互作用对微生物的组成影响最大，而单培养定殖、细菌的分离来源、肠道的环境过滤和线虫的免疫系统在组装过程中影响较小。该研究为进一步研究多物种群落组装过程提供了方法参考及数据支撑。
[1]Dirksen P, MarshSA, Braker I, Heitland N, Wagner S, Nakad R,et al. The native microbiome of thenematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMCBiol. 2016;14:1–16
