科研 | FRONT ONCOL：与鼻咽癌相关的肠道菌群失调和新的生物标志物（国人作品）
编译：蒋海叶，编辑：小菌菌、江舜尧。
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背景：鼻咽癌（Nasopharyngeal Carcinoma, NPC）是一种病因尚不明确的鼻咽部恶性疾病，多发于中国南方。肠道菌群失衡被认为与多种器官恶性肿瘤有联系，并发现肠道菌群改变是家族性肿瘤的发病原因之一；目前有研究揭示肠道菌群的紊乱与NPC相关，许多研究报道肠道菌群可作为多种癌症的生物标志物并对癌症具有预测作用。
方法：为了比较8例家族性NPC患者（familial NPC， NPC_F）、24例散发性NPC患者（sporadic NPC， NPC_S）和27例健康对照（NOR）三组之间的肠道菌群组成结构和生物学功能的差异，我们对三组的肠道菌群DNA进行测序，同时对试验对象的血液学指标进行检测，并通过生物信息学方法对肠道菌群测序和血液检测结果进行每两组间的比较分析。
结果：对59例参与者的肠道菌群进行分析，发现NPC患者肠道菌群结构失调。与NOR组相比，NPC_F和NPC_S的肠道菌群结构均发生显著改变；NPC_F中Clostridium ramosum，Citrobacter spp.，Veillonella spp.和Prevotella spp.等显著增多，而Akkermansia muciniphila和Roseburia spp.等显著减少。NPC_S中C. ramosum，Veillonella parvula，Veillonella dispar，Klebsiella spp.等显著增多，Bifidobacteriumadolescentis显著减少。进行Beta多样性分析显示，与NOR组相比，基于Bray Curtis指数NPC_F（P=0.012），NPC_S（P=0.337）；基于Unweighted Unifrac指数，NPC_F（P=0.0045），NPC_S（P=0.151）。基于两组NPC的差异菌属构建的预测模型绘制的ROC曲线下的面积AUC均为1。同时，NPC_F和NPC_S的5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）浓度也显著高于NOR组，C. ramosum与5-HT正相关（rcm:0.85，P<0.001）。肠道菌群功能分析提示，NPC_F与Neurodegenerative Diseases（P=0.023），Biosynthesis of Other Secondary Metabolites（P=0.038），Lipid Metabolism（P=0.073）相关；NPC_S与Neurodegenerative Diseases（P=0.045）相关。
结论：NPC的肠道菌群失调以可促进5-HT升高的C. ramosum和机会致病菌显著增加，而益生菌显著减少为特征，基于此可构建针对家族性NPC和散发性NPC患者肠道菌群失调的预测模型，可对NPC的高危人群进行疾病风险预测。C. ramosum作为NPC患者的新的生物标志物，可对NPC患者进行非侵入性早期筛查。
论文ID
原名：Intestinal flora disruption and novel biomarkers associated with nasopharyngeal carcinoma
译名：与鼻咽癌相关的肠道菌群失调和新的生物标志物
期刊：Frontiers in Oncology
IF：4.137
时间：2019.12
通讯作者：聂新民
通讯作者单位：中南大学湘雅三医院检验科
实验设计
结果
1 志愿者特征
8名家族性NPC患者，24名散发性NPC患者和27名健康志愿者的人口统计学和临床特征如表1。三个组之间的基线特征如年龄，性别和种族等无统计学差异。NPC患者的肿瘤分期情况如表2。8名家族性NPC患者的遗传图谱如图1。
表 1家族性NPC（NPC_F）、散发性NPC（NPC_S）和正常对照组（NOR）的人口统计资料表。
表2 招募的NPC患者(84例)、纳入的家族性NPC(8例)和散发性NPC(24例)患者的肿瘤临床分期表
图1 家族性NPC患者的遗传图谱，圆圈代表女性，正方形代表男性，黑色图案代表NPC患者，空白图案代表健康人；箭头所示图案表示参与本研究的患者。
2 血液学检测结果
通过对各组间血液学检测结果的统计分析，发现各组之间有多个临床指标存在显著差异（如表3）。值得注意的是，NPC组与NOR组相比hCRP的浓度存在显著差异（P=0.0047），这提示我们hCRP的血清浓度在NPC组中显著高于NOR组。我们使用ELISA方法检测血清中5-HT的浓度，如图2。NOR组中5-HT的血清浓度为（2.421±0.300） ng/mL，NPC_S组中5-HT的血清浓度为（2.986±0.207） ng/mL，NPC_F组中5-HT的血清浓度为（3.813±0.850） ng/mL。NPC_F组中5-HT的血清浓度显著高于NOR组（t=3.499, P=0.0014）和NPC_S组（t=3.841, P=0.00030），同时NPC_S组中5-HT的血清浓度显著高于NOR组（t=2.997, P=0.0046）。
表3 家族性NPC（NPC_F）、散发性NPC（NPC_S）和正常对照（NOR）组临床指标的检测结果及统计分析
图2 健康对照组(NOR)、家族性NPC (NPC_F)和散发性NPC (NPC_S)患者血清中5-HT的浓度，**P< 0.01, ***P < 0.001
3 肠道菌群的测序结果和统计分析
3.3.1 物种的丰富度和多样性
从所有59个粪便样品中总共获得3200797个可用的原始读数，每个样品平均读数为54251±4044。在使用CD-HIT聚类和NAST比对后，产生1828644个独特的代表性序列，得到OTU的总数为2894。我们利用三组的OTUs绘制了花瓣图（图3A）和系统发育树（图3B）。基于我们的测序数据所构建的稀释曲线（图4A，4B）已基本平稳，说明测序数据在该测序深度上已基本稳定，我们已经得到了样品中所含的大部分物种的多样性。
三个组的肠道菌群在门水平，属水平和种水平的分布情况分别如图5。我们发现在不同的分类学水平，三个分组的微生物群落组成均存在明显的差异。
图3 OTUs的比较与系统发育树图 (A)健康对照组(NOR)、家族性NPC患者(NPC_F)和散发性NPC患者(NPC_S)组的OTUs花瓣图；(B)系统发育树，左边的系统发生树由节点和分支组成，分支的不同颜色代表不同门水平的分类，每个节点的终端代表一个OTU，分支的最后代表相应的OTU在属水平的分类。右边的热图代表左边分支对应的属聚类的标准丰度，通过值-颜色标准化梯度呈现，颜色越红，值越大，丰度越高(门到属：p，门；g，属)。
图4 观测OTUs的稀释曲线（A）健康对照组(NOR)、家族性NPC患者(NPC_F)组和散发性NPC患者(NPC_S)组的稀释曲线；（B）所有样本的稀释曲线。
图5 健康对照组(NOR)、家族性NPC患者(NPC_F)组和散发性NPC患者(NPC_S)组在门，属，种水平上相对分类丰度的比较图 (A)三组在门水平上的分类单元相对丰度的柱状图；(B)三组在属水平上的分类单元相对丰度的柱状图；(C)三组在种水平上的分类单元相对丰度的柱状图。
3.3.2 不同组别间肠道菌群结构的差异
利用DESeq2方法对不同组别间肠道菌群在不同分类学水平的差异进行分析（如表3-4，表3-5，表3-6），NPC_F组和NOR组之间有23个属和28个种的相对丰度组成存在显著的差异；NPC_S组和NOR组之间有9个属和17个种的相对丰度组成存在显著的差异；NPC_F组和NPC_S组之间有13个属和22个种的相对丰度组成存在显著的差异。
表4 NPC_F组与NOR组之间有显著性差异的分类群表
表5 NPC_S组与NOR组之间有显著性差异的分类群表
表6 NPC_F组与NPC_S组之间有显著性差异的分类群表
LefSe结果（如图3-6和图3-7），在属的水平上，NPC_F、NPC_S和NOR三组间相比较，Clostridium，Eubacterium等在NPC_F组中显著增高，Bilophila在NPC_S组中显著增高。在物种的水平上，NPC_F组与NOR组相比，C. ramosum，C. symbiosum等在NPC_F组中显著增高，而A. muciniphila在NPC_F组中显著降低；NPC_S组与NOR组相比，C. ramosum和V. dispar在NPC_S组显著增高，B. adolescentis在NPC_S组中显著降低。
图 6 健康对照组(NOR)、家族性NPC患者(NPC_F)组和散发性NPC患者(NPC_S)组的肠道菌群组成特征图。
使用PCoA分析得到贡献率最大的前两个主要坐标PC1和PC2（解释变异分别为Bray-Curtis：12.2％和6.5％(图7A)，Unweighted UniFrac：12.4％和7.1％(图7B)）作图展示，发现NPC_F、NPC_S和NOR三组的肠道菌群分别在PCoA图上并未完全聚类，需要进一步对得到的Bray-Curtis和Unweighted UniFrac指数进行统计学分析来判断三组的肠道菌群结构是否差异显著。
PLS-DA分析所示（图7C），三个分离的聚类圈代表NPC_F、NPC_S和NOR组的肠道菌群明显区分成三个独立的群落簇，表明家族性NPC患者、散发性NPC患者和健康对照的肠道菌群的组成差异显著。ROC曲线下的面积AUC均为1（图7D），说明基于PLS-DA分析的区分家族性NPC组、散发性NPC组和NOR组肠道菌群的预测模型效果非常好，表明与NPC相关的肠道菌群是NPC的强预测因子，可将其作为NPC的危险因素，如C. ramosum，可将其开发为针对高危人群和NPC患者的生物标志物。
图7 健康对照组(NOR)、家族性NPC (NPC_F)患者和散发性NPC (NPC_S)患者微生物组的PCoA图和PLS-DA分析图。
计算NPC_F、NPC_S和NOR组的肠道菌群的Observed OTUs，Shannon指数和Faith’s phylogenetics diversity指数，基于这三种指数对三组的Alpha多样性进行统计学分析，发现三组间的统计学结果均不显著（图8）。同时，我们对NPC_F、NPC_S和NOR组每两组间的Beta多样性进行统计学分析，NPC_F和NPC_S组间，NPC_F和NOR组间Beta多样性差异显著均显著（图9，表7）。说明NPC_F、NPC_S和NOR组的肠道菌群的丰度和多样性均无显著差异。然而，NPC_F组相对于NPC_S组和NOR组在肠道微生物的结构上存在显著差异，提示家族性NPC患者的微生物结构与散发性NPC患者和健康对照组相比均发生了显著改变。
图8 基于不同指数对健康对照组(NOR)、家族性NPC患者(NPC_F)组和散发性NPC患者(NPC_S)组的Alpha多样性比较图。
图9 基于不同指数对健康对照组(NOR)、家族性NPC患者(NPC_F)组和散发性NPC患者(NPC_S)组的Beta多样性进行比较图。
表7 基于Bray-Curtis距离指数和Unweighted UniFrac距离指数对三组间Beta多样性的统计分析表（Anosim）
3.3.3 肠道菌群与多种临床变量的关联统计分析
根据属水平上的RDA排序图（图10）和相关性热图（图10），Oscillospira与多个临床变量有很强的相关性，与hCRP呈正相关（r：0.32，P=0.012）；与BMI（r：-0.30，P=0.022）、TC（r：-0.37，P=0.004）、UA（r：-0.36，P=0.005）呈负相关，与TBA呈弱正相关（r：0.17，P=0.200）。在物种水平上，C. ramosum与5-HT呈正相关（r：0.85，P<0.001），V. dispar与ALT呈正相关（r：0.30，P=0.020）。基于物种水平的RDA排序图（图11）和相关性热图（图11），C. ramosum与5-HT呈正相关(r: 0.85，P<0.001)，V. dispar与ALT呈正相关（r: 0.30, P=0.020）。
图10 肠道菌群与临床变量在属水平上的关系图。
图11 肠道菌群与临床变量在物种水平上的关系图。
3.3.4 物种相互作用网络分析
如图12A，C. ramosum与多种细菌具有显著的相关性，C. ramosum与多种机会致病菌如R. gnavus（r: 0.76, P<0.001），Eubacterium dolichum（r: 0.68, P<0.001），C symbiosum（r: 0.42, P=0.016）等正相关，而C. ramosum与多种有益的细菌如Roseburia faecis（r: -0.61, P<0.001）和F. prausnitzii（r: -0.49, P<0.001）负相关。这提示我们，C. ramosum可能是影响NPC发病机制的细菌，并为我们今后对与C. ramosum相关的条件致病菌和有益菌的研究提供了方向。同时，V. dispar与V. parvula（r: 0.73, P<0.001）和Haemophilus parainfluenzae（r: 0.55, P<0.001）正相关。
图12 健康对照组(NOR)、家族性NPC患者(NPC_F)组和散发性NPC患者(NPC_S)组之间的肠道菌群相互作用网络分析和功能预测。
3.3.5 肠道菌群功能的预测
为了确定三组肠道菌群的结构差异是否与NPC患者的肠道菌群的功能改变相对应，我们利用PICRUSt基于16S rRNA序列信息进行功能预测分析，并对预测功能进行PCA分析（如图12B），同时对第二KEGG-通路水平的预测功能在三组间进行比较（如图12C）。在第一KEGG-通路水平，NPC_F组的肠道菌群功能与人类疾病（Human Diseases，HmnD）（P=0.080）相关，NOR组的肠道菌群功能与有机系统（Organismal Systems，OrgS）（P=0.014）显著相关。在第二KEGG-通路水平，NPC_F组的肠道菌群功能与神经退行性疾病（neurodegenerative diseases）（P=0.023）显著相关，与脂质代谢（lipid metabolism）（P=0.073）相关；同时，NPC_S组的肠道菌群功能也与神经退行性疾病（P=0.045）显著相关；而NOR组的肠道菌群功能主要与免疫、消化、内分泌系统、能量和营养消化等功能相关。同时，通过Duncan检验，我们发现NPC_F组中的二苯乙烯、二芳庚烯和姜辣素的生物合成（stilbenoid, diarylheptanoid and gingerolbiosynthesis）肠道菌群功能相对于NPC_S和NOR组均显著增加，如图12D。从以上研究结果可以得出，肠道菌群的功能预测可以反映受试者的健康状况。NPC患者更容易发生神经退行性疾病，其肠道功能更可能与次级代谢产物的合成和脂质代谢有关；而NOR组的肠道微生物功能主要与免疫、消化、内分泌、能量和营养消化有关。
讨论
本研究通过对精心筛选的8例家族性NPC患者，24例散发性NPC患者和27例健康对照者的肠道菌群进行16s rRNA测序，并对他们血液的多项临床指标进行检测。利用生物信息学方法比较三组肠道菌群的结构和生物学功能的差异，探讨肠道菌群的改变与家族性NPC和散发性NPC的相关性，根据生物信息学方法分析NPC患者肠道菌群的功能，以期为NPC患者提供一种更好的生物标志物，并为高危人群构建一个疾病预测模型。我们还可进一步探讨肠道菌群的改变如何对NPC的发生发展产生影响，为NPC的预防和诊治提供新思路。
以下我们将对家族性NPC患者的肠道菌群中几种起主要影响的细菌进行讨论。与NOR组相比较，NPC_F组和NPC_S组肠道菌群中C. ramosum的丰度均显著增加。利用ELISA方法，我们发现NPC_F组和NPC_S组的血清中的5-HT水平均显著高于NOR组，同时我们的研究结果提示C. ramosum与5-HT显著正相关。C. ramosum是一种起源于肠道的孢子形成细菌，其代谢产物可以刺激ECs分泌5-HT。既往的研究证明C. ramosum在临床上是一种重要的机会致病菌，同时多项研究发现起源于人类胃肠道微生物群的孢子形成细菌可以调节ECs产生5-HT从而引起血清中5-HT的升高。人体中超过90%的5-HT是由ECs生物合成，5-HT可以通过激活肠上皮细胞，血小板和免疫细胞等不同类型细胞表面的不同的5-HTR，在人体生理功能中起着至关重要的作用。同时，许多研究发现多种肿瘤细胞表面的5-HTR亚型表达升高，这些肿瘤包括PC， HCC， CRC等。5-HT可通过激活肿瘤细胞表面的5-HTR亚型如5-HT1A、5-HT1B、5-HT2A、5-HT2B等，促进这些肿瘤的发生和进展。5-HT1B过表达于人类NPC病理标本，这提示我们鼻咽癌患者血浆中5-HT的升高可以通过激活5-HTR的功能进而促进鼻咽癌的进展。以上研究结果提示我们家族性NPC患者和散发性NPC患者的肠道菌群中显著增多的C. ramosum可能通过促进血液中5-HT水平的升高进而影响NPC的发生和进展。我们还发现家族性NPC患者的肠道菌群中C. ramosum的丰度和血浆中5-HT的水平均显著高于散发性NPC患者，这一结果可能是由于NPC_F患者有NPC家族史，在今后的研究中，我们将对家族性NPC患者的易感基因与肠道菌群的关系进行更深层次的研究。
在人体中A. muciniphila是一种具有抗炎作用的益生菌，A. muciniphila可将粘蛋白分解为对宿主有好处的代谢产物以塑造宿主肠道菌群的组成；并通过调节粘蛋白代谢和免疫反应对宿主产生有益的作用。既往许多研究发现A. muciniphila的水平降低与与许多恶性肿瘤的发生发展相关，比如CRC，乳腺癌等，并发现A. muciniphila在肿瘤对化疗药物和免疫检查点抑制剂的反应方面具有正向作用，甚至可以改善肠道微生物的组成结构。我们的研究发现家族性NPC中A. muciniphila的丰度显著减少。我们推测家族性NPC患者中A. muciniphila的减少导致对宿主有益的粘蛋白代谢产物水平的降低，破坏了宿主肠道屏障功能和免疫功能的自稳进而引发NPC。今后的研究我们将对A. muciniphila通过影响宿主粘蛋白代谢产物的合成以塑造NPC患者的肠道菌群结构，进而影响NPC的发生发展的机制进行进一步的研究。
Roseburia spp.在家族性NPC中显著减少，Roseburia spp.是产生人体所需的丁酸盐的主要细菌之一，丁酸盐在维持机体免疫自稳功能、调节代谢和控制炎症等方面具有重要作用，丁酸盐可通过多种途径来抑制肿瘤细胞的生长和增殖，如减少肿瘤基因组的突变和相关表观基因组的异常，抑制癌细胞的Warburg效应和致癌酶的作用以及促进异常细胞的凋亡等。动物和人体试验均发现丁酸盐具有预防CRC的作用，并发现丁酸盐可抑制多种肿瘤细胞系的生长。在一项研究中，发现CD患者的兄弟姐妹与CD患者具有相似的肠道菌群失调，肠道菌群的特征表现为低丰度的Roseburia spp.，提示Roseburia spp.具有家族性。因此我们相信Roseburia spp.的家族性很可能与NPC的家族性相关，这可以解释家族性NPC患者肠道菌群中因产丁酸盐的Roseburia spp.显著减少而导致患者体内丁酸盐的供应减少，从而引起机体与NPC相关的基因表达的异常，促进癌细胞Warburg效应的增强进而有助于鼻咽癌的发生发展。
接下来我们将对散发性NPC患者的肠道菌群中几种起主要作用的细菌进行讨论。V. parvula和V. dispar的丰度在散发性NPC患者的肠道菌群中显著增加。NPC患者通常出现颈部淋巴结肿大、鼻塞、鼻涕带血等炎症性的临床症状，研究发现肠道菌群中的Veillonella spp.与多种炎症性疾病相关。一项研究发现Veillonella spp.在CD患者的肠道菌群中的丰度显著增加，V. parvula与多种炎症性疾病如心内膜炎，脑膜炎和菌血症显著相关。V. dispar在自身免疫性肝炎患者的肠道菌群中显著升高，并发现该菌与患者血清中AST的水平及疾病的活动程度呈正相关。ALT和AST均可反映肝损伤，其中ALT反映肝损伤的作用更敏感。我们的研究发现V. dispar与ALT正相关。综上所述，散发性NPC患者的肠道菌群中的V. parvula和V. dispar作为条件致病菌可以对NPC患者的颈部淋巴结肿大等炎症性临床症状产生影响，还可能影响NPC患者的肝功能。另一方面，以上研究结果提示我们，NPC患者在诊断和治疗过程中应密切关注患者的肝功能。V. dispar可能可以协同患者血清中的ALT水平反映患者肝功能，并为NPC患者的疾病预防和病情控制提供依据。
我们发现B. adolescentis在散发性NPC患者的肠道菌群中的丰度显著降低。Bifidobacterium是一种益生菌，主要存在于母乳喂养的婴儿肠道内，这种细菌可代谢膳食纤维产生乙酸和乳酸，其中乳酸可被进一步代谢产生丙酸和丁酸。丙酸盐和丁酸盐对机体各组织器官的生理功能都有促进作用，既往的研究发现Bifidobacterium在宿主体内具有抗炎作用，同时，多项研究提示B. adolescentis的代谢产物具有抗炎活性。综上所述，散发性NPC患者的肠道菌群结构以促炎细菌C. ramosum，V. parvula和V. dispar显著增加，而益生菌B. adolescentis显著下降为特征，这些特征可能通过引起机体生理功能障碍，诱发机体的炎症状态，最终导致肿瘤的发生发展。
讨论
1.可促进5-HT升高的C. ramosum和机会致病菌Citrobacter spp.和Veillonella spp.的丰度增加，以及抗炎细菌A． muciniphila和产丁酸盐的细菌Roseburia spp.的丰度减少这很可能是人类家族性NPC肠道菌群失调的一个关键特征。可促进5-HT升高的C. ramosum和前炎症性细菌V. parvula和V. dispar的丰度增加，以及抗炎细菌B. adolescentis的丰度减少这很可能是人类散发性NPC肠道菌群失调的一个关键特征。
2.C. ramosum可通过促进血液中5-HT升高来影响NPC的发生发展，作为NPC患者的一种强危险因子，C. ramosum可成为NPC患者的一种新的生物标志物，可对NPC患者进行非侵入性早期筛查。
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