科研 | PNAS重磅：亚致死浓度抗生素对肠道菌群的破坏机制
编译：艾奥里亚，编辑：小菌菌、江舜尧。
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抗生素可以通过未知的机制，即使是在亚致死浓度下，也能对肠道微生物菌群中引起较大的影响。本文研究发现普通抗生素环丙沙星的亚致死剂量会导致斑马鱼细菌丰度的严重下降。与抗菌剂耐受性的传统观点相反，抗生素对于生长缓慢、易聚集类型的细菌的破坏程度要比对快速生长的物种更明显。活体成像显示，抗生素处理促进了细菌聚集，增加了肠道排出的易感性。因此，胃肠蠕动放大了抗生素对定殖的细菌的影响。另外文章基于生物物理模型探究了微生物动力学过程，该模型在软件中将抗生素诱导的塌陷与凝胶化相变联系起来，为预测抗生素对肠道微生物群的影响提供了一种方法。
论文ID
原名：Sublethal antibiotics collapse gut bacterial populations by enhancing aggregation and expulsion
译名：亚致死浓度下抗生素通过增强聚集和驱逐从而破坏肠道细菌种群
期刊：PNAS
IF：9.58
发表时间：2019.10
通讯作者：Raghuveer Parthasarathy
通讯作者单位：俄勒冈大学
实验设计
结果与讨论
1 低剂量环丙沙星增加细菌聚集和肠道排出
对于弧菌（Vibrio）和肠杆菌（Enterobacter），我们经验性地确定了环丙沙星的剂量，该剂量在体外引起细菌生理和行为的明显变化，这一浓度低于最低抑制浓度（MIC）。以Vibrio为研究对象，首先在体外和体内描述抗生素暴露的结果。
从富培养基中剂量反应的初步研究中，我们确定10 ng/mL环丙沙星为Vibrio菌群的适当暴露浓度。在1 ng/mL环丙沙星存在下，Vibrio的生长不受影响，而100 ng/mL的浓度在很大程度上抑制了Vibrio的生长。10 ng/mL的中等浓度导致稳定的中等吸光度。基于活性染色实验发现，10 ng/mL环丙沙星与Vibrio共培养6小时后，其中30%到80%的细胞仍保持活性，这与之前的结果相同，这说明在该浓度下，足以扰乱细菌种群但不具有致死性。在10 ng/mL环丙沙星存在下，会引起细胞形态和运动的显着变化：经处理后的细胞呈现丝状，其长度约为5.3±3.1µm，比未处理的细菌长得多(2.9±0.9µm)。与未处理细胞相比，处理的细菌游动速度也有所降低(处理组11.4±7.2µm/s，未处理组16.9±11.1µm/s)。此外我们还注意到，10 ng/mL环丙沙星与环境样品中通常测量的水平相当。
在水环境中，在无菌斑马鱼中接种106 cell/mL的细菌，随后定植24小时。然后将斑马鱼及其定植的Vibrio浸泡在10 ng/mL环丙沙星中24或48小时或不处理(图2 A和B)。通过肠道解剖和平板法测定菌落形成单位(CFU)以评估肠道中Vibrio的丰度。用平板法同样测定了水中Vibrio的丰度。我们通过计算处理和未处理组中细菌丰度的比率来量化抗生素处理的效果(图2C)。抗生素处理24小时后，与对照组相比，水环境中Vibrio的丰度下降了0.98±0.4，或平均下降了1个数量级（基于log10计算）。另一方面，肠道内Vibrio的丰度下降的更为严重，为1.75±0.88(图2C)，表明肠道环境放大了环丙沙星处理的效果。抗生素处理48小时后，水环境和肠道中Vibrio的丰度下降程度相似(图2C)。就绝对丰度而言，基于24至48小时处理汇总的数据计算得出log10数值发现，Vibrio的丰度为3.1±0.9(n=40)，而未处理样品的平均值为4.9±0.5(n=42)(图2D)。
为了评估肠道是否会使Vibrio更容易受到环丙沙星诱导而导致死亡，我们将幼年斑马鱼嵌入0.5%的琼脂糖凝胶中，以便可以收集排出的细菌。用活性染料SYTO 9和PI染料对排出的细菌细胞进行染色，基于成像我们发现，环丙沙星处理和未处理的微生物菌群之间没有可检测到的差异(图2f)。同样，无论是在处理组还是未处理组中，都可明显的观察到活细胞和死细胞，这一结果表明环丙沙星在体内观察到的种群数量下降与细胞死亡无关，是活菌对肠道环境响应的结果。我们还注意到肠道Vibrio丰度的剂量效应反映了体外生长速率的剂量效应，这意味着幼年斑马鱼肠道不会显著改变或浓缩环丙沙星。
为了研究环丙沙星对体内细菌丰度影响存在差异的原因，基于光片荧光显微镜监测了肠道内的Vibrio菌群的动态变化。3D延时成像显示，在环丙沙星处理的几个小时内，大量细菌从前段定植的可移动的菌群中耗尽。相反，在肠道的中段和远端发现了细菌细胞，在那里它们似乎是在被完全排出肠道之前被浓缩成大型的多细胞聚集体。暴露10小时后，环丙沙星处理的宿主中的Vibrio群体包含定植于肠道后部的大的3D聚集体，这一特征在未处理的对照(图2 E和F)中未观察到。我们还注意到，在体外，抗生素处理的Vibrio不会形成大的聚集体。
总之，基于以上数据，我们揭示了肠道放大低剂量环丙沙星作用的机制。单个Vibrio细胞首先经历与细胞形态和行为变化相关的SOS反应。在肠道的机械活动的背景下，这些分子和细胞水平的变化然后在整个肠道长度上引起群体水平的聚集和空间重组，群体向后移动其质量中心(图2G，n=4)。这一过程最终导致大型细菌聚集体从宿主中排出，导致总细菌丰度急剧下降。
2 小剂量环丙沙星抑制与肠道持久性有关的小团簇蓄积物
与弧菌（Vibrio）相比，肠杆菌（Enterobacter）生长较慢，不能运动，在斑马鱼肠道内自然形成致密的聚集体。Enterobacter在体内的生长速率为0.27 ± 0.05h−1，而弧菌的生长速率为0.8 ± 0.3h−1。基于抗生素耐受性的传统概念，我们假设Enterobacter受环丙沙星治疗的影响较小。但事实并非如此；Enterobacter对小剂量环丙沙星表现出更强的反应。
基于体外实验我们发现，25 ng/mL环丙沙星对Enterobacter生长的影响与10 ng/mL接触Vibrio的效果相似。采用与Vibrio相同的接种程序，通过实验我们发现，与对照组相比，水环境中Enterobacter丰度在24小时后下降了1.2 ± 0.4，在48小时后下降了1.8 ± 0.2（图3A）。富培养基中的测定表明，与Vibrio相比，Enterobacter在体外的细胞死亡和损伤程度甚至更低，其活细菌数占比约为95%。与Vibrio一样，体外生长测量和活性染色都表明，低剂量环丙沙星处理后抑制了Enterobacter的生长，而并非表现出致死性。
值得注意的是，低剂量环丙沙星处理下Enterobacter在斑马鱼肠道内定植的丰度远低于Vibrio，大多数种群在化验期间几乎或完全死亡(图3A和B)。与对照组相比，处理组Enterobacter在肠道的丰度在24小时后降低了2.3 ± 1.1，48小时后降低了3.2 ± 1.0(图3A)。这些肠道丰度的减少大大超过了水环境中细菌丰度的减少量(图3A)。就绝对丰度而言，基于24至48小时处理汇总的数据计算得出log10数值，得到处理组Enterobacter的丰度为1.5±1.0(n=40)，而未处理样品的平均值为4.0±1.0(n=39)（图3B）。
单个时间点的肠道群体活体成像显示，处理组中，40%的宿主中没有检测到或者检测到很少的Enterobacter，这与平板所得的结果一致。在含有可观细菌群的宿主中，我们观察到处理过和未处理过的标本之间的明显差异：与对照组相比，环丙沙星处理过的宿主中，Enterobacter包含更少的小细菌簇和更少的单个浮游细胞(图3C-D)。基于计算图像分析进行量化发现（将单个细胞定义为大小为1的簇）：与对照组相比，处理组细菌种群减少了约80倍(图3C)。活性染色显示，从未处理和处理宿主的肠道排出的细菌的活分数没有明显差异(图3D)。与Vibrio一样，这些观察表明Enterobacter在肠道内丰度的减少与细胞死亡无关。
基于延时3D成像，探究了小剂量环丙沙星处理下Enterobacter形成的细菌簇是否会通过肠道排除。在每个3.5小时成像的5个宿主中的2个，我们观察到最大的细菌聚集体突然从肠道排出的现象(图4A)。这些延时影像表明，其中单个细胞和小聚集体似乎聚集在一起并融合，这一过程可能是由于在帧之间发生的有节奏的肠道收缩。重要的是，在这些排泄事件中，除了少数在运输过程中融入到大团块中的簇以外，优先定位于肠球的较小聚集体和浮游细胞相对不受干扰。
基于以上结果，我们提出：Enterobacter的单细胞聚集形成小簇，然后在肠道流动的影响下聚集形成更大的簇。大簇由肠道的节律收缩输送，并被宿主排出。留在肠道内的单个细菌和小簇充当了重新播种的种子，重复进行此过程。因此，肠道内的持久性需要产生单个细胞或小簇的过程；否则运输最终将导致灭绝。这种重新播种可以采取以下形式：
1)新细胞从环境中迁移，
2)群集的被动碎裂，
3)主动碎裂，其中单个细胞在细胞分裂期间脱离群集表面。
3 细菌团簇动力学的定量模型
为了巩固和检验我们的概念图，我们建立了一个细菌簇动力学的预测数学模型。借鉴非平衡统计力学等思想，我们构建了一个普适性的动力学模型，描述了一组大小不同的细菌簇的时间演化（如图4B）。我们假设有4个过程主导这种动态变化：聚集、碎裂、生长以及驱逐。每个都由一个核心来描述，该核心指定其速率和大小依赖关系：
1）以Amn速率将大小分别为n和m的簇聚集在一起；
2）以Fnm的速率将大小为n+m的团簇分解成大小分别为n和m大小的团簇；
3）由于细胞分裂，大小为n的簇以Gn速率生长；
4）由于肠道蠕动，大小为n的簇以En速率被排出。
然而，与聚合物溶液和其它块状体系不同（他们所含有的簇可能是无线的），我们的肠道群体被限制为具有至多几百个簇(图3c)，有必要使用随机模拟。因此我们提出几点假设：
1）两个簇之间的聚集率与它们的大小无关，Anm=α；
2）分解仅通过分离单个细胞发生，其速率与簇的大小无关，对于m=1来说 Fnm=0，对于其他m值来说Fnm=β；
3）增长是具有全部承载能力的理论值，可表示为Gn = rn(1-N/K )，其中N表示全部细胞数量，r代表平均增长率，K代表负载能力；
4）排除与簇的大小无关，En=λ。
即使有上述假设，该模型也需要5个参数：聚集率、分解率、增长速度、扩散速率和全部承载力。然而，所有这些参数可以通过与簇大小分布无关的实验推导出的值来设置。我们通过对刚接触Enterobacter前8小时的无菌宿主进行时间推移成像，测量了Enterobacter的平均增长率，其平均生长速率满足r = 0.27 ± 0.05 h−1（n=3）。我们定义Enterobacter的排除（驱逐）是其丰度随时间推移出现的一种突然崩溃（图3C），其排除速率等于测量的塌陷速率，满足λ = 0.11 ± 0.08 h−1。可以模拟模型以在给定时间对给定参数集提供log10-变换的丰度分布的平均值和方差。
因此，该模型允许对在图5A中绘制的Enterobacter聚集体的尺寸分布进行无参数预测，以及从3D图像得到的测量分布。在12组未处理的宿主中有两个出现了惊人的一致。我们也同样地绘出了累积分布函数P(大小＞N)、簇将包含大于N个单元的概率，再次验证模型的有效应。
4 丰度相位图和死亡
我们的动力学模型对低剂量抗生素对肠道菌群的影响提供了见解。为了简单地说明，我们采用了一个2d形式表示，其中一个轴是分解率和聚集率的比率，即β/α，另一个是生长和排出速率的比率，即r/λ（图5B）。如上所述，所研究的模型中的模型应依赖于比率，而不是独立于单位或单位。然而，r和λ的作用并不是简单地由它们的比率所识别。我们对模型的稳态相图进行了数值计算同时图5B给出了丰度的平均log转化率。基于研究发现，低剂量环丙沙星引起小细菌簇的数量的强烈减少，β值的下降以及单个细胞分裂被连接。保守地假定沿两个轴的相等效果，并对24h处理丰度进行拟合模拟，我们发现抗生素减少了进10倍的r以及β/α。这促使细菌系统通过相界进入灭绝状态（图5B橘黄色部分）。
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