科研 | 气候变暖下多年冻土融化对细菌群落及潜在有氧呼吸的影响
本文由木木的天空编译，董小橙、江舜尧编辑。
原创微文，欢迎转发转载。
导 读
气候变暖使得多年冻土融化过程中大量土壤有机碳（SOM）分解。而SOM的分解可能不仅仅是由于温度升高单方面所引起的：冻土融化间接的改变细菌群落结构(BCS)或生根模式的研究目前尚未被充分探索。作者使用10年时间进行原位多年冻土融化实验和有氧培养来研究不同深度的BCS和潜在呼吸的变化, 以及它们相互关联的程度和根密度的关系。结果表明多年冻土融化对土壤有机质（SOM）分解的间接影响是通过对土壤有机质分解驱动因子(BCS)的影响来实现的，这对在气候变暖背景下理解和预测多年冻土融化时究竟是碳源碳汇具有重要意义。
论文ID
原名：Long-term in situ permafrost thaw effects on bacterial communities and potential aerobic respiration
译名：气候变暖下多年冻土融化对细菌群落及潜在有氧呼吸的影响
期刊：ISME
IF：9.520
发表时间：2018.6
通信作者：Sylvain Monteux
通信作者单位：Department of Ecology and Environmental Sciences
实验设计
作者通过对实验场地进行原位添加雪栅栏来以减少多年冻土冻结层厚度进行模拟气温变暖实验，研究了长期原位多年冻土融化的直接和间接效应如何改变活动层和上部多年冻土土壤的BCS和潜在土壤呼吸，并研究这些响应是否有联系以及如何相互关联。
假设（a）：十年原地冬季变暖和相关的多年冻土融化将改变活动层和多年冻土层的BCS，改变最强烈之处在新融化和根系新殖入的土壤深度。
假设（b）：活动层的潜在呼吸强度将随十年冬季变暖而降低，而新融化的多年冻土层的潜在呼吸强度将增强。这是由于活动层温度在升高十年后，不稳定碳底物的长期耗竭造成的。相比之下，中间层在每个生长季节结束时只融化了很短的一段时间，因此预计由于BCS的变化（例如，向具有更高功能多样性的群落的转变）而使得该层土壤的呼吸作用增强。
假设（c）：包括BCS—即系统分类组成和植物根密度的信息将改善基于土壤化学的活动层潜在呼吸强度和多年冻土融化的预测。
文章特色
实验设计特色：研究多年冻土融化的微生物生态学的常用方法有自然融化梯度法和实验室培养法。自然融化梯度为气候变暖的未来影响提供了现实的代用指标，但深层土壤融化地点的历史可能与当前的浅层土壤融化地点不同。在不同深度的土层剖面中，BCS随深度变化较大，多年冻土融化所导致的土壤沉降和压实程度随含冰量的变化而变化。因此,确保在多年冻土融化之前，沿着假定的融化序列进行比较的群落没有差异是一项具有挑战性的工作。通过对融化和培养冻土样品的重复取样可以避免这种潜在的影响，但非原位处理的方法忽略了融化的间接影响，例如通过土壤动物和根部的定殖。因此，作者抛弃上述不严谨的实验，在野外建立了长期诱导多年冻土融化实验，通过实验增加雪栅已达到冬季保温的效果来模拟冬季气候变化，可以检测融化的这些长期间接影响。这种实验装置还可以在监测沉降的同时，对给定深度的土壤进行更精确的取样。此外,通过仔细选择地块和随机处理，使得最初相同的微生物群落得到了保证，排除了空间梯度固有的潜在混淆效应。
图1 12块有雪栅栏和没有雪栅栏的样地在泥地上的位置
实验结论特色：研究结果为冻土融化过程中BCS的响应提供了第一个原位实验证据：在多年冻土的土壤中，长期冻结限制可能是BCS比土壤深度本身更重要的决定因素，一旦这些限制得到缓解，上覆的微生物似乎就会迁移，从而决定了最终的BCS。证实测定细菌群落结构(BCS)可以提高对多年冻土碳反馈的预测。根密度可能通过根际激发效应、SOM池耗尽或根际BCS的改变的遗留效应进而影响土壤的呼吸作用。
实验方法
1 深度融化实验场地设计
研究场地位于瑞典北部靠近阿比斯库的一块泥炭地。自2005年起，每年冬天，在12块(10×10米)随机抽取的土地上，在6块土地上竖起10米长、1米高的雪栅栏，冬季平均积雪增加2.6倍(16-24厘米)，冬季土壤温度(15厘米)增加1.5摄氏度，活动层厚度（ALT）增加29厘米(2015年数据未展示)，并进一步称之为“深度融化”。其余六块样地，周围积雪(6-9厘米)作为对照处理。其影响包括阔鞘小芹的生长和覆盖增加，及土地沉降的增加（2012年与2005年相比平均下沉为24 cm，而对照样地为5 cm），导致在一些深度融化区形成季节性池塘。深度融化地块内外甲烷排放量均不显著，故未对甲烷动态进行研究。
图2 (A)实验处理组的涝渍图；(B)同日的对照处理图（摄于：2011.5.11）
2 样地设计及BCS、植物及非生物的取样分析
划分三种深度下土壤碳和微生物的动态变化取样规则：活动层(深度融化区和对照区均位于融化层以上、地下水位以下，约为55 cm)；中层(对照地块冻结，深度融化地块季节性融化，约70 cm)和多年冻土层(在深度融化及对照地块均为多年冻土层，在融化面以下至少10厘米，100-125厘米)。
图3 冻土土壤剖面示意图
2015年9月，在活动层厚度（ALT）最大值前后，每块地采集2个土芯，使用泥炭取芯器对融化的土壤进行取样，使用定制的气动力无液混凝土钻孔机（直径10.2厘米）对冻土取样。由于深度融化地块内活动层厚度（ALT）随距离雪栅栏的变化而变化，所以我们选取ALT > 80cm的点取芯，但对照组土壤取样未采用ALT标准取芯。冻土土壤土芯用无菌去离子水冲洗以限制土层之间的钻探污染，然后用塑料薄膜包裹并储存在一个较冷的盒子里长达3小时。
将一组土芯在2℃下融化，然后从上述三处深度土芯中各取2g土壤样品进行DNA的提取，取样时用乙醇清洁过的镊子在距离核心表面至少3cm处取样，以使污染最小化。
在这些取样深度周围再取3个30厘米长的土芯，每个土芯约1L（通过水位移估算）进行人工采集各芯段的粗根（> 0.5mm），在60℃下干燥称重以计算土壤中根的密度（g干重根/ L土壤）。由于采样误差，在这组土芯中没有取得中间层在深度融化地块中的重复样品，因此排除了BCS和根系密度的分析。
第二组土芯在-20℃下保存至2016年4月，然后在4℃下融化后取其亚样品进行土壤化学分析和有氧培养。通过经乙醇清洁过的2mm筛子对这些子样品进行筛选。均质土壤等分试样用于测量潜在的有氧呼吸（见下文），作为土壤碳脆弱性的指标。此外，我们使用9g的亚样品测定重量水含量和有机质含量（OMC）。由于在大多数样品中，硝酸盐和亚硝酸盐浓度低于检出限（约12.2μgNO3 - -N / g干土），由此不再关注该指标。
3 土壤的培养
对于两不同处理中三个取样深度的六个重复中的每一个，将两份20g（鲜重）均质土壤的等分试样放入用橡胶隔板封闭的250mL玻璃罐中，并在11℃或21℃的暗培养室中培养。采用密闭玻璃注射器采集玻璃罐顶部空气（10ml），用红外气体分析仪测量CO2浓度，并且采用仪器内部校准和静态采样的模式，每隔1—5天进行一次，为期1个月。当一个样品浓度达到≥10000ppm时，所有的罐子都用400ppm的CO2合成空气冲洗，这足以将顶部CO2浓度降低至400ppm。均质化1个月后，呼吸速率稳定下来，然后再进行4次以上的测量，每次从400ppm(通过如上所述进行冲洗以达到该浓度)开始，持续12天。这四个测量值被用来计算CO2的产生速率（τ）如下所示：
图4 CO2的产生速率（τ）
其中（Δt）1-2是冲洗（1）和测量（2）之间的时间间隔，Pi是冲洗或测量时的大气压力，V是顶部空间体积，R是理想气体常数，和T的培养温度。然后取这四种呼吸速率的平均值来估计潜在的有氧呼吸速率(以下简称为呼吸)。
基于在11和21℃条件下各测的的平均值，计算每个重复土壤样品的呼吸温度敏感性(Q10)。潜在呼吸率表示为每单位土壤干重（体呼吸）或每单位有机质干重（内在呼吸）。
4 细菌群落
根据细菌分类和亲缘关系的生态学特征，推断受深度融化处理影响的最丰富OTUs的生态标志。
5 统计分析
所有统计分析均使用R v3.4.1进行。利用线性混合效应模型的方差分析，评估深度融化处理和土壤深度在11℃时对潜势呼吸的影响，其指标包括Q10和土壤非生物变量(OMC、pH、NH4 +和土壤水分)，以处理和深度为固定因素，以土芯为随机因素，并在适当时进行两两对比。对NH 4 +以及体积和内在潜在呼吸进行对数转换，并对OMC进行平方根转换以改善残差的正态性。
通过使用广义线性模型测试每个OTU与负二项分布的偏差来评估深度和处理对BCS的影响，这与基于距离的方法相比混淆了位置和分散效应。从平均丰度表中计算加权单裂缝距离的主坐标分析排序，利用envfit()检验其与根系密度和土壤变量的关系。
实验结果
1 土壤化学性质与根系密度
对照组中的多年冻土层PH值高于活动层，而实验组中的多年冻土层PH值与活动层无差异。NH4 +不受土壤深度和处理的影响(表1)。根不能长到冻土里，因此，根系密度分布反映了土壤是否季节性冻融循环。大部分根系生物量属于莎草和灌木。
表1 十年原位深度融化和不同深度对土壤非生物变量、呼吸速率及细菌群落结构（BCS）的影响；环境变量与BCS之间的关系。
2 细菌群落结构
BCS随深度变化很大，且还受到十年原位深度融化处理的影响，但这种影响仅在不同深度的土层间存在差异(表1，图5)。总的来说, BCS在三个季节性融化的土壤层中没有差异（两种处理中的活动层，深度融化中的中间层;图5a ）。而三种多年冻土层(控制处理的中间层和对照处理中的两种多年冻土层)与季节性融化的土层不同(图5a)。季节性融化的土壤在中间层从而导致了10年内的BCS与活动层土壤无法区分。从门水平上来看，这种从常年冻结的土壤转变为季节性融化的土壤时，SBC的特征是厚壁菌门和嗜热丝菌门的大量减少，以及酸性细菌相对丰度增加(图5b)。土壤含水量、OMC、根系密度主要与PCo1相关，反映了深度和融化的强烈影响，但NH4 +与PCo2相关。
图5 基于16S rRNA V3区域的细菌群落结构。A：加权UniFrac距离的主坐标分析；标记和误差条分别表示每个深度x处理组合纵坐标上的平均误差和标准误差(n =6，中间层深度融化的n=5除外); 同的字母表示显著不同的群体。B：每个深度×处理组合中门的平均相对丰度; 虚线矩形包含永久冻结的样本。C ：149个OTUs在深度融化和对照处理之间中间层的门分布、丰度和丰度变化。每个条形代表一个OTU的对照和深度融化样品之间倍数变化的log2倍数; 点表示整个稀疏数据集中的OTU相对丰度，黑点表示OTUs丰富(>0.5%); 图例中OTUs的数量为中间层，而百分比显示了其中的哪一部分在(C)中。
3 潜在的有氧呼吸
在有氧土壤培养条件下，测量的体呼吸速率（每克土壤干重）在多年冻土层中比在上覆层中低85％，且在各土层深度融化处理中进一步降低了61%（41-74％）（无深度×处理的相互作用；表1，图6a ）。相比之下，深度或处理对内在潜在呼吸(每克有机质干重)没有总体影响，但深度x处理的交互作用显著(P=0.037，表1，图6b)，与对照相比，深度融化区土壤的活动土壤层的潜在呼吸降低了45%(26—59%)，中间土壤层的潜在呼吸降低了18%(10-39%)，但高于对照土壤多年冻土层的74%(30-134%)。同样，处理或深度对呼吸的温度敏感性没有主要影响(Q10，计算温度在11-21℃之间)，但深度x处理的显著交互作用表明，Q10在中间冻土层和多年冻土层之间的变化主要集中于深度融化区(表1)。
图6 在11℃实验室培养期间，对照和十年内原位深度融化土壤中不同深度土壤的潜在有氧呼吸，在培养1个月后1周进行测量，分别用每克土壤干重表示体呼吸（A）和每克土壤有机物用内在呼吸表示（B）; 虚线右边的样品来自永久冻结的土壤层;
4 潜在呼吸的非生物和生物驱动力
体呼吸模型最适合无交互作用（对截距的处理效果）时的数据，而内在呼吸模型中，处理与其他预测因子的交互作用显著改善了模型的拟合（对斜率和截距的影响;图7）。虽然土壤PC1斜率与零没有差异，但对照和深度融化样品之间对于细菌PCo1和土壤PC1的显著不同的斜率反映了先前描述的内在呼吸的深度×处理相互作用（图6b、图7和表2）。
结合BCS和土壤化学的模型最好地描述了体积和内在潜在呼吸，与基于土壤化学的模型相比，AICc分别减少了8.43和4.33（表2 ）。当仅包含细菌PCo1时，体呼吸的适应性更差，但对于内在呼吸其效果优于仅具有土壤PC1的模型。仅使用细菌PCo1进行内在呼吸的模型与包括土壤PC1和细菌PCo1的模型相似且能够良好的拟合（表2 ）。
图7 截距和斜率（95％CI）的最佳拟合呼吸对土壤化学（土壤PC1）和细菌群落结构（细菌PCo1）的多元线性回归。星号表示处理之间的显着差异（P <0.05）。注：int表示为截距
表2 对照和十年原地深度融化样地中不同深度土壤在11°C培养下土壤潜在呼吸与土壤化学，细菌群落结构和根密度之间的多重回归分析
讨 论
根据我们假设（a），BCS对深度融化处理的响应在多年冻土从永久冻结变为季节性融化的中间层中最强（图5）。深度融化中间层的BCS与活动层群落趋同的结果，支持了前人研究的BCS在活动层和多年冻土之间不同的观点，以及多年冻土在离开原位土体进行融化后的活性层中发现的BCS的聚集。此外，尽管这种趋同性也可能部分源于某些内源性类群的差异生长，但季节性融化土壤之间惊人相似的群落表明，表层土壤微生物迁移到了新融化的土壤上。之前的一项研究比较了同一深度的季节性冻土区和多年冻土区的BCS与火灾后冻土区退化的BSC，但在那项研究中其火和融化的效果并不是一致的。因此，我们的研究结果为冻土融化过程中BCS的响应提供了第一个原位实验证据。在多年冻土的土壤中，长期冻结限制可能是BCS比土壤深度本身更重要的决定因素，一旦这些限制得到缓解，上覆的微生物似乎就会迁移，从而决定了最终的BCS。
虽然深度融化实验增加了上层土壤的含水量，但这种影响并没有延伸到我们取样的深层土壤。相反，两种处理之间假定的有氧和厌氧OTUs的相对丰度的增加表明，氧气可能已经到达了深度融化地块的更深的土层，因为那里的阔鞘小芹菌更为丰富。相反，处理之间推定的有氧和无氧OTU的相对丰度的增加表明，在深度融化地块中氧气可能已经到达更深的土壤层，其中阔鞘小芹更丰富。绒螯草根系具有通气细胞，可能使深层土壤含氧量增加。在多年冻土层中发现嗜热丝菌门的相对丰度较高(高达60%)(图5b)。这个鲜为人知的门有一个培养的代表，并且已经在其他极端环境中被发现。Wurzbacher等最近表明，神秘的微生物门在多年冻土融化池中占主导地位。我们观察到的高相对丰度的结果表明，至少在我们的研究系统中，完整的多年冻土层可以通过培养和组学的方法来研究嗜热丝菌门生态学。
对于假设（b），深度融化样地活动层土壤的潜在呼吸速率低于对照土壤(图6)。相比之下，在该实验的最初几年中观察到深度融化样地的生态系统呼吸强度较高，但此时土壤中ALT及融化的SOM的增加仍然是有限（~6 cm）。正如Semenchuk等人在类似的实验中所建议的那样，我们认为，由于十多年的操作过程中温度升高及融化时间延长，SOM的分解和处理能力增强，使得不稳定的碳库逐渐耗尽。
在中间层，我们假设(b)由于微生物功能多样性的增加会导致潜在呼吸量增加，但这一假设遭到了驳斥:在深度融化区，体呼吸和内在潜在呼吸量都出现了下降。在多年冻土融化后，快速的代谢反应促进了SOM分解，这可能在短期内增加碳的损失。短时间的氧化作用，例如通过阔鞘小芹气叶前叶，可以通过促进苯酚氧化酶活性进而对分解产生持久的影响，并且在考虑到观察到的有氧和厌氧OTU相对丰度的变化，这似乎是合理的。此外，尽管我们假设中间层中较短的融化期会延迟这种效应，但如上述类似的温度效应可以通过不稳定的碳库耗尽，进而导致10年后观察到的较低的呼吸速率。深度融化中间层Q10值的升高进一步支持了这一观点，表明其化学顽固性增强。虽然先前已经提出使用不稳定的碳库的耗尽来解释土壤呼吸为何会减少，并且符合我们的观察结果，但是，为了证实这种解释，有必要在长期实验中结合有机质剖面对土壤呼吸进行综合测量。冻土层的深度融化效应与冻土层的体呼吸作用减弱和内呼吸作用增强相反。深度融化最多可使仍然冻的土壤土层的温度最多升高不到1摄氏度。结合观察到的较高的内在呼吸速率，因此上述不稳定的碳库耗尽似乎也不太可能适用于冻土。另外,在深度融化和控制多年冻土层中，不同的SBC可能在功能上是不同的，这可能是导致观察到的呼吸差异的原因所在。但是，我们不愿将其作为单一的潜在机制提出来，因为受处理影响的唯一丰富的OTU由于其与所有培养生物的高度差异性而无法提供功能性见解。此外，尽管受处理影响的OTUs可能反映了温度对多年冻土层BCS的影响，但它们相对较低的数量也可能表明多年冻土土壤中的低种群规模加剧了空间取样数据分析的效应。
我们的假设（c），其中包括生物群可以改善基于土壤化学对潜在呼吸预测，而这一假设得到了体呼吸和内在呼吸的支持：包括BCS导致更好的拟合模型。此外，土壤化学和BCS与处理的显著交互作用，以及两种处理之间斜率的相反方向，其强烈表明，在10年深度融化条件下，内在呼吸的驱动因素发生了根本的变化(对照样土的内呼吸随OMC升高而升高，而深度融化样土的内呼吸随OMC升高而降低)。尽管包括BCS在内的所有模型的拟合效果都明显好于纯土壤模型，但土壤化学本身几乎同样能很好地解释体呼吸速率。相比之下，BCS单独解释内在呼吸速率比土壤化学更好，这意味着在考虑到不同的OMC后，BCS比土壤化学可以更好地解释呼吸速率的变化。我们不能排除微生物量或其他土壤化学指标，如SOM的顽固性，其可以解释呼吸的额外变化。此外,如果BCS和呼吸作为共同的驱动因子共享了这些未测量的变量，那么我们目前认为BCS造成的一些变化实际上可能是由其他因素造成的。这里使用的基于16的群落配置文件仅提供了关于功能潜力的有限信息。然而，我们的结果与最近的证据一致，表明细菌分类组成可以解释呼吸变异的一个独特部分(如：农业温带土壤)，并在一定程度上决定土壤碳动态，尤其是那些在微生物活动受限制较少的有机土壤中。虽然在群落功能方面的潜在机制尚不清楚，但我们的结果表明，测量BCS可以提高对多年冻土碳反馈的预测。
与我们的假设(c)相反，包括根密度并没有改善体积或内在潜在呼吸作用的模型。根密度可能通过根际激发效应、SOM池耗尽或根际BCS的改变的遗留效应进而影响土壤的呼吸作用。根密度对我们的模型的有限贡献与在泥炭地中观察到的相对较小（4％）的激发效应一致，而根际BCS效应可能已经被整体变化的BCS所解释，因此只能解释BCS所贡献的部分信息。除了在培养期可能观察到的这种遗留的影响之外，较高的根系密度也可能直接影响原位土壤呼吸，例如通过刺激根际微生物活动或通过增加SOM转换而不影响SOM池的大小。使用不同的实验设计，例如根部外围，可能使根定植效应的直接和遗留效应与融化的其他后果分隔开来。
结 论
作者的原位方法证实了之前在冻土冻融试验中观察到的多年冻土冻融后BCS的巨大变化，并进一步表明，活动层细菌的定殖可能决定了多年冻土融化过程中BCS的响应。尽管根系密度在预测呼吸作用方面似乎没有提供足够的信息，但土壤中BCS和潜在呼吸作用之间的紧密联系挑战了土壤中BCS对C循环不重要的观点，至少在我们的系统中是这样，尤其是在考虑到SOM含量的变化之后。这个BCS—C循环链，以及其对潜在的功能影响，应该在其他受到多年冻土层影响的环境中进行研究，因为其可能意味着目前对多年冻土层融化过程中SOM分解的预测中忽略了一个重要的组成部分。综上所述，研究结果表明，多年冻土融化对土壤有机质（SOM）分解的间接影响是通过对土壤有机质分解驱动因子(如BCS)的影响来实现的，这对理解和预测多年冻土融化时的碳反馈具有重要意义。
你可能还喜欢
培训班推荐👇，快来参加，充实自己吧！