eLife | 美国科学家使用 CRISPR-Cas9 预防小鼠 Fuchs 角膜营养不良
在一项新研究中，俄勒冈大学菲尔和佩妮奈特校区加速科学影响的研究人员使用 CRISPR-Cas9 基因编辑启动密码子破坏来预防小鼠的 Fuchs 角膜营养不良。 这是首次证明使用该技术（称为起始密码子破坏）来治疗有丝分裂后组织中的遗传疾病，并有可能通过取代角膜移植的需要来彻底改变 Fuchs 营养不良的治疗。 它还可能导致其他遗传疾病的新疗法，甚至影响非生殖细胞的疾病。
新论文“用 CRISPR/Cas9 启动密码子破坏可防止小鼠 Fuchs 的内皮角膜营养不良”，由 Knight Campus 研究教授 Balamurali Ambati 领导，并发表在 eLife 杂志上。
该论文详细介绍了一项为期 8 年的研究结果，该研究涉及一种影响全球大约 2,000 人中的一种疾病的疾病。 Fuchs 的角膜营养不良导致角膜内皮细胞死亡，引起肿胀，从而导致视力下降、疼痛、视力障碍和失明。
“有很多人在努力防止这些细胞死亡，但最终面临的挑战是这些是有丝分裂后的细胞——你天生就有你将拥有的细胞，当它们开始死亡时就会变成 一个问题，”安巴蒂说。
目前，Fuchs 营养不良的唯一治疗方法是角膜移植，这是一项具有相关风险和许多潜在并发症（如感染、排斥和青光眼）的大手术。 这种疾病是美国角膜移植的主要原因，虽然角膜组织在美国很容易获得，但在世界大部分地区都供不应求。
研究人员专注于该疾病的一个早发子集，通常在 30 多岁或 40 多岁的时候袭击患者。 他们将注意力集中在称为 COL8A2 或 VIII 型 α 2 型胶原蛋白链的胶原蛋白中的单点突变。
“之前证明的是，如果你敲除这个基因（COL8A2），角膜就很好，”安巴蒂说。 “特别是这种蛋白质的这种突变形式导致了问题。”
研究人员试图测试敲除该蛋白质是否可以为该疾病提供一种新的治疗策略。 他们转向 CRISPR-Cas9 基因编辑以靶向成年突变小鼠的致病蛋白，但面临在有丝分裂后细胞上使用该技术的挑战。
“对于有丝分裂后的细胞，诱导同源重组非常困难或不可能。因此，我们必须考虑其他方法来实现我们的目标。” Ambati 实验室的研究员、论文的主要作者 Hironori Uehara 说。
Uehara 开发了一种通过靶向起始密码子来阻断 COL8A2 基因表达的创新方法。 起始密码子是蛋白质合成的起始位点。 起始密码子的破坏可导致蛋白质表达的终止。 靶向其他位点也可以通过移码终止蛋白质表达，但它可能会诱导其他不需要的蛋白质表达。 目标距离起始密码子下游越远，导致活性未知的突变蛋白的错义突变的风险就越大。
“我们确定我们可以破坏起始密码子，从而通过将基因疗法传递到角膜来选择性地降低该蛋白质的表达，”Ambati 说。
研究小组通过编码 SpCas9 的腺病毒进行治疗，并通过将 RNA 注射到小鼠眼前房中，直接面对角膜内皮细胞。 在检查治疗安全性的研究中，他们确定周围组织不受基因治疗的影响。 他们研究了其他脱靶基因以确保它们没有受到影响，并确定最大耐受剂量对视网膜、虹膜和眼睛的其他部位是安全的。
研究小组表明，他们不仅可以保持角膜内皮细胞的密度和结构，还可以挽救其功能。 在诱导肿胀的功能性抢救测试中，他们对角膜做出了一些令人惊讶的次要发现。 如研究人员预期的那样，将水应用于角膜并没有引起肿胀。 相反，他们确定肿胀是由房水通过角膜内皮（角膜的背面）进入角膜引起的，因此在去除上皮后角膜表面的高渗溶液挑战导致了最严重的角膜肿胀 .
该研究小组使用了马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学威尔默眼科研究所的 Albert Jun 博士培育的小鼠，该小鼠的突变与导致人类 Fuchs 营养不良的突变相同。 Jun 是该论文的特约作者。
该研究为未来研究使用 COL8A2 基因敲低作为治疗动物、非人类灵长类动物和最终涉及人类的临床试验的 Fuchs 营养不良的可行性奠定了基础。 Ambati 说，减少 Fuchs 营养不良患者对角膜移植的需求可以间接帮助其他需要角膜组织的患者。 未来的研究还可以探索 Cas9 介导的基因敲低对具有单点突变的有丝分裂后细胞中的其他遗传疾病的影响，包括神经系统疾病、免疫疾病和某些影响关节的疾病。
“它有可能将 CRISPR-Cas 系统的治疗靶点扩展到不能进行细胞分裂的组织，”Ambati 说。
Hironori Uehara et al, Start codon disruption with CRISPR/Cas9 prevents murine Fuchs' endothelial corneal dystrophy, eLife (2021). DOI: 10.7554/eLife.55637
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