Nature Chemistry长文解析：α-Syn聚集通过相分离成核
导读：
生物聚合物(蛋白质和RNA)的液液相分离(LLPS)已成为细胞内无膜细胞器形成的关键现象，包括核仁、Cajal 小体和早幼粒细胞白血病小体以及细胞质中的应激颗粒等。这些液体凝聚物将生物分子（蛋白质和核酸）浓缩在不同的细胞位点以执行各种细胞功能。α-突触核蛋白(α-Syn)是一种天然的非结构蛋白，其聚集成细胞毒性的寡聚体和淀粉样原纤维与帕金森病(PD)有关。虽然α-Syn的聚集机制是一个广泛研究的领域，但这一过程涉及的早期事件尚未清楚。印度孟买大学团队在《Nature Chemistry》杂志（IF=21.687）发表了题为“α-Synuclein aggregation nucleates through liquid–liquid phase separation”的研究论文，作者团队使用体外重组和细胞模型揭示了α-Syn的液液相分离要先于它的聚集，在体外产生的α-Syn液体样液滴经历了液体到固体的转变，并最终形成了一个含有寡聚体和原纤维的淀粉样水凝胶。低pH、替代磷酸化和突变等加重α-Syn聚集的因素，也促进了α-Syn液-液相分离及其随后的成熟过程。作者进一步证明了体外培养的HeLa细胞中α-Syn液滴的形成并最终转化为核外聚集体，且该过程由微管调节。这些发现表明相分离是迈向与PD病理学相关的α-Syn聚集的第一步，为帕金森病的发病机制提供了新见解。
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体外α-Syn的LLPS
为了预测α-Syn的LLPS，作者分别用SMART和IUPred2运算法则去检测低复杂度结构域（LCDs）和本质无序区域的存在。SMART分析预测了两个LCDs（残基10-23和63-78，图1a)和IUPred2揭示在α-Syn序列中有三个片段（残基26-28、54-56和99-140，图1a）。在诸如 10% 聚乙二醇 (PEG)-8000 之类的分子聚集体存在下，α-Syn 显示在体外浓度≥200µM 时形成液体状液滴（图1b）。使用异硫氰酸荧光素 (FITC) 标记的 α-Syn（10% 标记）蛋白通过光散射和荧光成像进一步证实了液滴的形成（图1c）。值得注意的是，10% 标记蛋白质的存在并未改变 α-Syn 的主要生物物理特性。此外，增加分子拥挤会降低用于相分离的蛋白质的临界浓度（图 1d），这表明分子拥挤引起的局部浓度增加足以启动α-Syn 的LLPS。
为了开发相体系，作者比较了不同浓度和不同pH值（pH5.4和7.4，在没有和存在10%PEG的情况下）下α-Syn的相分离。在低pH（5.4）时，α-Syn在没有和存在PEG的情况下，即使在10µM和5µM浓度下也会形成液滴（图1e）。因为蛋白质的相分离与温度有关，作者用200um的蛋白浓度研究了4°、18°、25°和37°C的条件下α-Syn的LLPS发现48h后α-Syn在所有温度（4°C除外）下形成液滴。为了检查与温度相关的可逆性，α-Syn液滴(d2)接受了高温(65°C)的测试。这些液滴最初在1小时后消失，但在37°C冷却后在3小时内重新出现，这表明它们具有可逆的和类似液体的性质。相比之下，老化的（d20）液滴对高温（65°C）不敏感。当加热到65°C持续6h时，只有液滴的尺寸减小，而随后在37°C孵化持续24h时液滴的尺寸完全恢复(图1f)。这表明α-Syn液滴随着时间呈液体到固体的转变，类似于其他蛋白质，包括FUS、TDP-43和tau。
图1 α-Syn在体外经历LLPS
液滴内α-Syn分子的动力学
接下来作者研究了液滴中α-Syn分子在其形成和成熟过程中的动力学特性。作者观察到由于 Ostwald 成熟和液滴融合，液滴的大小随着时间推移而增大（图2a）。例如，作者发现两个液滴合并形成一个更大的液滴（图2b），这表示液滴的融合。此外，较小液滴的逐渐消失及同时附近较大液滴的生长表明Ostwald成熟的可能性。为了表征液滴内蛋白质的动力学，作者在光漂白实验后使用rhodamine标记的 α-Syn(rhod-α-Syn)(10% labelled) 形成的液滴进行荧光恢复（FRAP）。与FITC类似，10% rhodamine标记蛋白的存在并不会改变α-Syn的任何生物物理特性。液滴形成（d2）后，FRAP研究发现了一个快速（半衰期（t1/2）为3.75s）且完全的荧光恢复（~96%）。然而，随着时间的推移，动力学和恢复率大幅下降(在d20时的恢复率为7.5%)（图2c-e）。从t1/2中作者估计d2、d5和d10的蛋白质分子的表面扩散系数(Dapp)分别为0.584、0.23和0.18um2s–1（图2f）。FRAP恢复的减少（随着老化）表明了材料性质（如刚性）的变化，这可能是由于液滴内蛋白质的聚集。在液滴成熟过程中内部α-Syn的分子扩散减少可能归因于液滴粘弹性的变化。尽管 FRAP 测量提供了有关 α-Syn 在液滴中的平移动力学的信息，作者进行了基于显微镜的时间分辨荧光各向异性衰减，以揭示 α-Syn局部和全局水平的旋转动力学。在不同的时间间隔测量了内部(P1)和外部(P2)FITC标记的α-Syn液滴的各向异性衰减（图2g），数据清楚显示，与外部相比(ɸ=1.0ns)，液滴内部的蛋白质分子旋转运动减少，因此刚性更大（在d2的旋转相关时间（ɸ）=1.6ns）（图2h）。然而，与从液滴外部获得的衰减模式不同，从它们内部获得的各向异性衰减显示出渐近点的y截距。这反映了由于分子的较高刚性而存在的很长的相关时间(C)的振幅。此外，在d10时液滴内的α-Syn分子比刚形成的d2液滴(ɸ=1.6ns)更具刚性(ɸ=1.8ns)。这些观察结果连同FRAP恢复数据，清楚地指出了α-Syn在老化时的从液体到固态的转变。
图2 LLPS中α-Syn的动力学会随着时间的推移而减慢
PD相关因子和家族性突变加速α-Syn LLPS和聚集
PD主要是一种散发性疾病，环境和细胞因素在该疾病的发病机制中起着重要作用。金属离子、与脂质膜的相互作用、Ser129磷酸化和家族性突变等因子对PD发病机制中的α-Syn聚集起着关键作用。为了实现相分离和聚合之间可能的相关性，作者监测了在有无金属离子(Cu2+和Fe3+)、脂质体、拟磷酸S129E和最典型的家族性突变体A53T和E46K的情况下α-Syn的LLPS和聚集动力学。作为对照，作者还通过单独的野生型 (WT) α-Syn（不含 PEG）和在多巴胺（一种已知的 α-Syn 原纤维形成抑制剂）存在下监测 LLPS 和聚集。PD促进因子加速α-Syn聚集，硫黄素T(ThT)荧光分析显示(图3a）及其相应的滞后时间减少(扩展数据图1)证明了这一点。此外，经透射电子显微镜(TEM)证实，聚集状态显示出淀粉样原纤维。相比之下，多巴胺延迟了聚集，而单独的α-Syn即使在孵化30天后也没有显示出任何聚集(图3a）。重要的是，当作者在相同的实验条件下分析LLPS时，发现即使在没有PEG的情况下，Cu2+、Fe3+和脂质体也加速了液滴的形成(图3b)。此外，在存在≥1%PEG时，S129E拟磷酸α-Syn在相同条件下与野生型相比，分离速度更快。除了更快的液滴形成率外，许多这些因素还降低了LLPS所需的临界浓度。例如，α-Syn在100um Cu2+或1mM脂质体存在下形成5um浓度的液滴。这表明，这些因子水平的升高增加了α-Syn的分子间相互作用，因此降低了其相分离的临界浓度。同样地，两个家族性突变体A53T和E46K，在体外比野生型α-Syn聚集得更快(图3a)以及在PEG存在下分别于24小时后、48小时后相分离(图3b)。相比之下，当多巴胺存在时直到d20才观察到野生型α-Syn(10%PEG)的LLPS，这也被TEM分析证实。此外，即使经过一个月的孵化，这些水滴也没有生长大小，这表明成熟速度非常慢。此外，即使经过一个月的孵化，这些液滴的大小也没有增长，这表明成熟速度非常慢。对存在PD因子和没有PD因子的情况下形成的液滴的FRAP分析显示，荧光回收率百分数相似（Cu2+和Fe3+除外），但回收率显著降低（更高t1/2和更低Dapp）（图3c,d）。这表明在这些 PD 相关因子存在的情况下，液滴中分子的平移动力学较慢，这可能最终导致聚集增强并使液滴过早成熟。基于显微镜时间分辨各向异性衰减的α-Syn 液滴测量显示，与不存在这些因素时形成的液滴相比，在存在 PD 相关因子的情况下，各向异性衰减动力学（增加 ɸ 和 %C）要慢得多（图3e-g）。这进一步支持了在PD相关因子存在下形成的α-Syn液滴内分子的刚性高于在PEG存在下形成的液滴内分子的刚性。
图3 PD相关的聚集因子促进了α-Syn的LLPS
LLPS 和液固转变过程中 α-Syn 的聚集状态
为了建立α-Syn聚集（寡聚体和原纤维的形成）和LLPS之间的直接相关性，作者同时使用ThT荧光和各种显微技术监测聚合动力学。此外在LLPS和聚集过程中作者分离并量化了随时间形成的不同α-Syn种类的相对数量（来自同一样本）（图4a）。以前也用过类似的方法来分离α-Syn的寡聚中间体。利用TEM的圆二色性和形态对分离种类的二级结构进行了表征。聚合动力学和LLPS结果表明，液滴是在聚集的早期滞后阶段形成的（图4b,c）。对不同种类的定量表明，在LLPS的早期(d5)约90%为低分子质量的α-Syn（主要是单体)、少量寡聚物(约8%)和原纤维 (约2%）（图4b）。然而，在液滴成熟过程中观察到低分子质量种群的显著减少和原纤维的增加，寡聚物的数量从d10到d30保持不变，这表明寡聚体中间体可能已达到稳态（图4b）。TEM和圆二色性数据表明，低分子质量分数大多是非晶形的，具有随机线圈结构。寡聚体部分主要显示出具有螺旋结构的球状形态(d5和d10除外)。纤维部分主要含有具有β片段结构的淀粉样。尽管四聚体和膜结合单体 α-Syn 富含螺旋结构是已知的，但在 α-Syn 聚集过程中，寡聚体α-Syn富含螺旋结构也很明显。总的来说，数据指出了各种α-Syn种类（单体、寡聚物和纤维）之间的动态相互作用，在LLPS过程中，单体通过寡聚物介导的过程逐渐转化为纤维聚物。
此外，作者还在整个LLPS和聚合过程（d30）中，用显微镜在不同的时间间隔检查了液滴。野生型α-Syn(ThioS)染色在相分离开始的背景中显示扩散荧光信号，然而在后期(d5以后)，Thios很容易共分割成液滴，这表明了淀粉样聚物的存在。TEM成像进一步证实了这一点，显示了d30的纤维聚集体(图4c)。有趣的是，在d20之后，作者观察到蛋白质聚集物从液滴的子集中出现（图4d），当使用高分辨率TEM成像时，在单个液滴内观察到纤维状结构（图4e）。在d30后，LLPS溶液经凝胶反转试验和扫描电子显微镜(SEM)确认，转化成了水凝胶（图4f)。用α-Syn水凝胶进行频率扫描体积流变测量显示超过损失模量（表面粘度G）的更高的存储模量（表面弹性G），表明凝胶和/或类似固体的行为（图4g)。
接下来，作者验证这两种家族性突变A53T和E46K是如何调节α-Syn的液固转变和凝胶形成。除了数量增加、形成更大体积的液滴和更高的光散射外，两个突变体都显示出了更快的聚集。此外，与野生型α-Syn相比，ThioS早期分割A53T和E46K液滴(在d2)，这表明A53T和E46K在液滴内能更快地聚集到淀粉样原纤维中。与野生型蛋白相比，这两种突变体也表现出更硬的水凝胶形成。
图4 α-Syn 相分离液滴成熟并老化成纤维状聚集体
负责 α-Syn LLPS 的域相互作用
为了确定残基特异性水平上LLPS的域相互作用，作者记录了二维[15N-1H]单核单量子相干(HSQC)谱。作者选择了野生型α-Syn和两个家族性突变体(A53T和E46K)来比较结构域相互作用的程度。直接维数(HN)中的窄信号色散表明了蛋白质的无序状态。在LLPS过程中，野生型α-Syn显示在N端（V3-A27、V37-K43和H50-E57)和NAC区域（V74-V82和A89-K97）处的残基强度逐渐下降，C端（I112-N122）的残基强度降得更低（图5a,b）。突变体A53T和E46K也有类似的观测结果但有一个N端和NAC区域的核磁共振信号的快速降低。对于E46K，在d3后，大部分残基的酰胺交叉峰消失而出现新的峰，这表明构象的重大变化。在d20时，核磁共振信号的广泛展宽和移动表明，这三种蛋白都形成了高阶结构。因此，核磁共振数据表明除了无序的N端外，疏水的NAC区域也可能与α-Syn LLPS有关。用α-Syn位点特异性的单Trp突变体(N端，3W；NAC区域，71W；C端，124W)的时间分辨荧光衰变测量进一步支持了这一推论。以前研究表明在这些位置引入Trp并没有改变α-Syn的性质。时间分辨荧光强度衰减分析表明，由于LLPS，Trp探针的局部环境没有实质性变化（图5c,d）。然而，从更快的相关时间（ɸ1)及其振幅(α1）可以明显看出在LLPS之后N端和NAC区域的结构刚度比C端要高得多(图5e,f)。 为了检查 N 端和 NAC 区域的结构刚性是否是由于相分离后的分子间相互作用，作者进行了 Förster 共振能量转移 (FRET)实验。使用标记有 DTNB 的 α-Syn 的单个半胱氨酸 (Cys) 突变体作为受体，而互补的 Trp 突变体作为供体。与 N 端和 NAC 区域相比，LLPS 早期 C 端的能量转移效率较低（图 5g）。这表明 N 端和 NAC 区域的域间相互作用可能会驱动α-Syn液滴的形成。
为了进一步确定这些结构域参与液滴成熟为类固体相的过程，作者以单液滴分辨率对α-Syn NAC结构域进行了FRET显微观察。选择了位于第74位的荧光素-5-马来酰亚胺标记的α-Syn作为供体以及位于同一位置的rhodamine-c2-马来酰亚胺标记的α-Syn作为受体。利用这些方法，制备了三个相分离的样品，只包括供体（荧光素-α-Syn）、只有受体（rhodamine-α-Syn）和等摩尔比的供体受体。包含供体和受体的单个液滴的能量映射和空间分辨荧光成像显示，当选择性激发供体荧光团时，受体荧光团的致敏发射增强(图5h)。这是供体分子间蛋白的特征，因为接近相当一部分供体和受体标记的蛋白。此外，在每一个液滴中，敏化发射（或明显的FRET效率）的增强程度（由于能量转移引起的强度增强因子，IEFET）随着孵化时间的推移而逐渐增加（图5i），这表明每个液滴中的α-Syn分子越来越接近。α-Syn NAC域在LLPS中的重要性进一步明显，因为β-突触核蛋白在NAC域中缺乏8个疏水氨基酸延伸，既没有显示聚集，在实验条件下也没有显示LLPS。有趣的是，在LLPS相关的条件下，另一个人类突触核蛋白γ-突触核蛋白也没有显示任何相分离和/或聚合，即使在延长孵化。γ-突触核蛋白聚集非常缓慢，这可能是由于C端没有两个Tyr残基，以及NAC结构域的三种甘氨酸被具有高电荷的谷氨酸残基取代。相比之下，与野生型α-Syn相比，α-Syn核心（30-110个残基）表现出更快的聚合和LLPS，这进一步证明了核心/NAC域对LLPS的重要性。
图5 LLPS 期间 α-Syn 的位点特异性构象变化和动力学
哺乳动物细胞中α-Syn的LLPS和液固转变
为了证明细胞中的α-Syn LLPS，作者培养了HeLa细胞，过度表达四半胱氨酸标记的α-Syn(C4-α-Syn)24和48小时，随后用FlasH-EDT2染色C4-α-Syn。只有约20%的细胞显示细胞质蛋白积累，而其余细胞显示C4-α-Syn的扩散泛细胞定位(图6a)。基于铁与α-Syn之间可能存在的病理联系，作者研究了铁对细胞中α-Syn LLPS的影响。引人注目的是，在用10mM柠檬酸铁铵处理24小时后，>95%的细胞显示出细胞质液滴样集合（每个细胞285±116液滴）(图6a)，平均直径0.46µm(图6b）。48小时后，这些液滴主要聚集并定位在核外区域。然而，液滴的数量在48小时后后显著减少（每个细胞76±21个液滴），其平均直径增加到0.61µm(图6b)。这24 小时液滴是高度移动的并经历了频繁的融合事件，迅速弛豫成球形组件（图6c）表示它们的液体样状态。这些液滴没有显示任何与尼罗河红色（脂滴染色）和膜结合细胞器（溶酶体和线粒体）标记物的共聚，这表明它们的无膜质状态。
为了检查C4-α-Syn分子的动态特性，作者进行了细胞内的FRAP。作为对照组，选择了具有扩散表达的区域来确定FlAsH染色的C4-α-Syn的细胞内动力学。作者发现无液滴区域的部分恢复(t1/2=10±3.04恢复约56%)，这表明C4-α-Syn在细胞环境中扩散缓慢。24小时处理后，与48小时相比，液滴内的荧光恢复速度更快，表明α-Syn分子在24小时时可以在细胞质池扩散和平衡，这与类液体的状态性质一致（图6d）。48小时的动力学减少可以归因于液固转变，可能是由于C4-α-Syn在这些液滴中的聚集。当细胞用另一种金属离子Cu2+处理时，也观察到类似的液滴形成和液固转变。然而，与铁诱导液滴（48 小时）相比，铜诱导液滴的成熟更快（36 小时），这与体外 FRAP 和各向异性研究一致（图 3）。
随后，作者在细胞内进行了单粒子跟踪测量以研究单个α-Syn液滴在24小时和48小时后的扩散动力学。24小时后的分析显示液滴具有主要的超扩散行为（指数α>1），这表明液滴主动或促进的运动，可能是由细胞机器辅助的(图6e)。计算出的粒子轨迹的平直度也与其α值呈正相关，这进一步支持了这些类液体液滴的定向运动。然而，在48小时后，大多数液滴的α分布转移到较低值（α≤1）(图6e），表示一种（子）扩散行为，可能由液滴大小及其微环境控制。
为了探讨α-Syn液滴的超扩散位移的机制和微管的可能参与，用微管解聚合剂nocodazole对细胞进行了处理。在微管不稳定时，大多数液滴在24小时内聚集在一起（图6f）。微管去稳定后α分布显示了值≤1的相当大的变化，这表明自由和/或亚扩散运动(图6e）。这支持了微管网络参与液滴的运动，表明类液体的α-Syn液滴的迁移最初在微管的帮助下更有方向，但在液固转变及其对核外区域的定位后大大减少。
图6 细胞中 α-Syn 的液体状凝聚物
α-Syn的液固转变触发了聚集体形成
随时间推移α-Syn液滴变成了更刚性的组件，作者验证LLPS是否会在细胞中触发α-Syn淀粉样蛋白聚集。使用淀粉样特异性OC抗体与α-Syn在不同时间的免疫共沉淀来检测纤维的形成。点迹分析显示，随时间推移，处理和未处理细胞的OC信号都在增加（图6g）。然而，与未处理的细胞相比，处理48小时后的细胞OC免疫反应活性显著增加。引人注目的是，细胞活力仍然没有受到影响，这可能是由于核周聚集体的形成。事实上，由于 Fe3+ 或 Cu2+ 处理在 HeLa 细胞中形成了聚集体，这通过α-Syn 与 ProteoStat（一种聚集体标记）和相应的 聚集体倾向因子的共定位得到证实（图6h）。总的来说数据表明金属诱导的LLPS触发细胞的聚集体形成，这是由微管调节的。
图7 α-Syn LLPS和聚合的潜在机制示意图
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编译 / 陈雄金
校审 /蔡玉洁
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