细菌蛋白表达载体pBAD是什么?
pBAD载体系统是用于在细菌中表达重组蛋白的可靠且可控的系统,该系统通过araBAD操纵子控制大肠杆菌L-阿拉伯糖的代谢。将目的基因置于pBAD载体中araBAD启动子的下游,当L-阿拉伯糖存在时,araBAD启动子驱动目的基因的高效表达;当葡萄糖存在时,目的基因的表达则被抑制。该载体系统可精确控制目的基因的表达,特别适用于生产困难蛋白,如具有毒性或不溶性蛋白。
亮点
首先,将目的基因克隆到pBAD载体上,并将携带该质粒的菌株在缺乏L-阿拉伯糖的生长培养基中培养以降低质粒不稳定性。然后,通过向培养基中加入L-阿拉伯糖来诱导目的基因的表达。
pBAD载体上携带的双向araBAD启动子可同时驱动目的基因和调节蛋白AraC的表达。在缺少L-阿拉伯糖的情况下,AraC在启动子区域二聚化形成环阻断转录。当添加L-阿拉伯糖时,AraC改变构象并结合到启动子中的替代位点,从而激活转录。
向生长培养基中添加葡萄糖,宿主细胞cAMP水平降低,可以进一步抑制目的基因的本底表达。在无葡萄糖的培养基中,cAMP水平很高,cAMP-CRP(代谢物激活蛋白)复合物会与pBAD启动子结合,从而抑制目的基因的表达,这将有利于表达具有细胞毒性或抑制细菌生长的目的基因的表达。
所有定制的pBAD载体都会克隆在能够保持质粒稳定的大肠杆菌中(如Stbl3),可将质粒转移至缺乏L-阿拉伯糖分解代谢基因的宿主菌株(如TOP10)中,使目的基因有效且稳定的表达,因为L-阿拉伯糖的浓度不会随着时间的推移降低。对于需要利用葡萄糖严格抑制本底表达的,则应该使用LMG194宿主菌株。该菌株能够在基础培养基(RM培养基)上生长,可通过葡萄糖进一步抑制araBAD启动子。
优势
表达高度严谨:pBAD载体系统比pET载体系统的表达更严谨。在缺少L-阿拉伯糖的情况下,目的基因可能只有非常低的本底表达,但可通过葡萄糖进一步抑制。
诱导强度高:araBAD操纵子系统是高度可诱导的。在去除葡萄糖并添加L-阿拉伯糖后,可实现>1000倍的诱导效率。
诱导成本低:L-阿拉伯糖价格低廉,大规模蛋白表达经济实惠。
宿主要求:与pET载体不同,pBAD载体可以稳定存在于表达菌株中,如TOP10。
不足之处
表达水平次于pET载体:基于pBAD载体系统的重组蛋白水平低于pET载体系统。
诱导物代谢:野生型大肠杆菌可分解L-阿拉伯糖。当表达目的蛋白时,应该使用L-阿拉伯糖分解代谢突变的宿主菌株(如TOP10或LMG194),以避免由于培养基中L-阿拉伯糖的降解而引起表达不稳定。