《中华肝脏病杂志 》：HBV RNA的临床研究进展
中华肝脏病杂志，2020.28（12）：1055-1058
作者：许艺凡 雷学忠
DOI:10.3760/cma.j.cn501113-20190308-00074
摘要
HBV RNA 在乙型肝炎病毒复制过程中具有重要作用，尤其是前基因组 RNA（pg RNA）作为复制过程中病毒核心逆转录的模板，其特殊性被日益重视。本文分析了近年来有关 HBV RNA 的临床研究，进一步探讨 HBV RNA 作为新的血清学标志物对临床乙型肝炎患者的指导意义。
正文
据估计，全球有 2.57 亿乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染者，每年因乙型肝炎相关的肝硬化和肝细胞癌导致约 88.7 万人死亡 [1] 。而目前我国仍大约有 7 400 万慢性 HBV 携带者，约占全球感染人数的 1/3，从 2015 年到 2030 年预计约有 1 000 万人将死于乙型肝炎相关肝硬化和肝癌 [2] 。在乙型肝炎监测、管理、消除的道路上我国任重而道远。近年来对 HBV RNA 的研究发现其与 HBV 感染的自然史、HBV 病情进展等方面关系密切，对临床的指导意义亦日益受到重视。本文分析了近年对 HBV RNA 的临床研究，以期更好的指导临床中乙型肝炎的管理。
一、
HBV RNA 与慢性乙型肝炎的监测评估
1. HBV RNA 与乙型肝炎感染自然史：
早期有研究表明 HBV RNA 具有区分不同感染阶段的潜力。近期 Liu 等的研究纳入了 291 例初治慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者，结果显示在慢性 HBV 感染的过程中，各阶段血清 HBV RNA 水平不同 ：HBeAg 阳性组患者血清 HBV RNA 明显高于 HBeAg 阴性组，而在 HBeAg 阴性的患者中，非活动性的CHB 组血清 HBV RNA 水平最低 [3] 。此研究证实了 HBV RNA 预测 CHB 进展的潜力。然而鉴于 CHB 监测过程中疾病的进展及医疗干预，纵向的研究较为困难。2017 年欧洲肝病协会指南以 HBeAg 阳性和阴性将 CHB 感染史分为不同时期 [4] 。随着 HBV RNA 在感染自然史中的作用被揭示，可能为我国修改及制定 HBV 感染分期标准提供新参考。
2. HBV RNA 与其他血清学标志物：
临床上，我们观察到长期抗病毒治疗的患者 HBV DNA 的水平显著下降，但共价闭合环状 DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）可持续存在，患者难以获得持久的免疫学控制。理论上，HBV RNA 只由 cccDNA 产生，其相关性应高于其他指标 [5] 。蒋贝等发现经恩替卡韦治疗后血清 HBV DNA 已降至低于检测下限的慢性乙型肝炎患者中仍有部分患者可检出 HBV RNA，而血清 HBV RNA 仅来源于 cccDNA 的直接转录，故比 HBV DNA 和 HBsAg 更 能 反 映 cccDNA 水平或者活性 [6] 。Giersch 等 [7] 通过小鼠模型证明未经治的小鼠血清 HBV pgRNA 与肝内 cccDNA 具有良好相关性（ r = 0.89， P < 0.000 1）。Huang 等 [8] 的研究发现初治 CHB 患者血清中 HBV DNA 联合 RNA 可反应肝内 cccDNA 的活性，但近来有不少研究发现 HBcrAg（乙型肝炎核心相关抗原）与 cccDNA 具有良好的相关性且可能优于 HBV RNA [9 - 10] 。血清中 HBV RNA 与 HBV DNA、HBsAg 的相关性目前存在分歧，回顾既往的研究可发现，对于初治的 CHB 患者，尽管在 HBeAg 阳性与 HBeAg 阴性的患者中存在差异，但总体上，血清中 HBV RNA 与 HBV DNA、HBsAg 具有较好的相关性（表 1）[3，8，10 - 13] 。而对于治疗后的 CHB 患者，各研究结果具有较大的差异 ：Mu 等 [14] 发现 HBeAg 阳性的患者，经干扰素治疗后肝内 HBV RNA 与 HBV DNA 具有较好的相关性（ r = 0.739， P = 0.001）；而 Luo 等 [15] 经多变量因素分析得出血清 HBV RNA 与血清 HBV DNA 无相关性、与 HBsAg 相关性较弱（表 2）；Liao 等 [16] 的研究发现经 NAs 治疗的患者HBV RNA水平与HBcrAg显著相关（ r = 0.629，P < 0.001）。造成上述差异的原因可能是治疗方法、血清学转换、早期病毒学应答等因素的影响，同时由于研究本身的异质性，如研究对象、地区、种族差异以及检测方法的差异，因此各研究得出的结论不同。值得考虑的是，将血清 HBV RNA 联合其他指标共同评估 CHB 患者在临床工作中是可行的，其临床意义有待更多纵向研究去评估。
二、
HBV RNA 与抗病毒治疗
1. HBV RNA 与抗病毒治疗方案：
目前应用于临床抗病毒治疗 ：核苷 ( 酸 ) 类药物 [nucleot（s）ide anologues, NAs] 以及干扰素。Wang 的研究中 11 例 CHB 患者，NAs 治疗后 HBV RNA 下降 [17] 。Luo 等同样发现经恩替卡韦治疗后，病毒学应答的患者血清 HBV RNA 是降低的 [15] ，可能的原因是 NAs 药物耗竭了 HBV RNA 的模板 - cccDNA。Jansen 等研究表明，与单药相比，基于干扰素的治疗更显著地降低 HBV RNA 水平 [18] 。Jia 等的研究表明对于初治 HBeAg 阳性的患者基线时 HBV RNA > 200 000 拷贝 /ml，干扰素治疗 12 周后 HBV RNA > 3 000 拷贝 /ml，在治疗 24 周时很难实现血清学转换，以此来评估干扰素治疗获益，从而优化抗 HBV 治疗，这也为抗病毒治疗的个体化提供了新的评估手段 [12] 。
2. HBV RNA 预测病毒学应答及血清学转换：
越来越多的研究表明，患者血清 HBV RNA 水平可以预测病毒学应答及血清学转换 [11，19 - 21] ，早前 Huang 等发现 NAs 治疗第 12 周时，血清 HBV RNA 水平可作为独立因素预测慢性 HBV 患者初始病毒学应答 [19] 。van Bommel 等与 Huang 结论相同，同时发现其预测能力优于 HBV DNA、HBsAg [20] 。Luo 等及 JiaW 等的研究分别阐述了经恩替卡韦（ETV）、干扰素或者干扰素联合 NAs 方案治疗后，HBV RNA 水平在病毒学应答（Viral Response）组更低 [12，23] ，进一步证明了其预测病毒学应答的能力。
此外，上述研究均显示发生 HBeAg 血清学转换的患者 HBV RNA 水平显著降低。近期 Wu 等也得出同样的结论，并发现 NAs 药物初治患者 HBV RNA 低于 4.12 拷贝 /ml 更容易发生血清学转换，而是否发生血清学转换受基因型、年龄、性别、治疗前后的 HBV DNA 水平及丙氨酸转氨酶（ALT）水平等多种因素影响，HBV RNA 可作为评价血清学转换的独立因素 [21] 。除了探究接受 NAs 药物治疗患者 HBV RNA 对于血清学转换的影响，Van Bommel 及 Jia 等的研究均证实了在接受聚乙二醇干扰素（Peg - IFN）治疗期间，HBV RNA 可作为评价 HBeAg 血清学转换的新指标 [11 - 12] 。
迄今为止，尚未确定 HBeAg 血清学转换特异性的预测因子。但值得肯定的是，HBV RNA 能够预测经治患者病毒学初始应答，目前大多数证据表明 HBV RNA 可作为一个独立因素协同判断 HBeAg 阳性患者的血清学转换，优化乙型肝炎患者的监测及管理。
3. HBV RNA 与新型抗病毒药物：
HBV RNA 对新型抗病毒药物的研发也有指导意义。其中一类主要针对核心蛋白的装配，称作核心蛋白质变构调节剂（ core protein assembly modulators，CpAM），其作用于病毒 pgRNA 的壳体化和病毒复制过程中起重要作用的位点。与 NAs 药物相较，NAs 仅抑制 HBV DNA 复制，但不阻断 pgRNA 衣壳化或 HBV RNA 病毒样颗粒产生，而 CpAM 抑制 pgRNA 装配入壳 [22] 。但无论是 CpAM 还是 NAs 均不能阻止感染的肝细胞中 cccDNA 转录或 HBsAg 产生。另一类可能作为研究新靶点的是 HBV 核糖核酸酶 H（RNaseH），目前 Gotchev 等 [23] 研究已显示RNaseH 抑制剂（AB - 452）可降低小鼠的血清 HBsAg 和肝内 HBV RNA 水平。
三、
HBV RNA 与安全停止抗病毒治疗
何时停止抗病毒治疗是目前具有争议性的话题。有研究回顾分析了 12 个研究中心 126 例停止抗病毒治疗的 HBeAg 阴性的 CHB 患者，认为血清 HBV DNA 低于 3.0 log 拷贝/ml（≈ 2×10² IU/ml）、HBeAg 的血清学转换、接受长期治疗是成功停止 NAs 药物的必要条件，同时该研究发现治疗结束时 HBsAg 和 HBcrAg 滴度是安全停止治疗的预测因素 [23 - 24] 。而实际上，目前长期治疗的患者均符合上述条件，然而停药后病毒学反弹及乙型肝炎复发率仍很高。一项纳入 36 例 CHB 患者的研究表明血清 HBV DNA 水平联合 HBV RNA 水平可预测停药后病毒学反弹水平 [25] 。北大鲁凤民教授团队建议将传统的基于病毒 DNA 检测的病毒学应答重新定义为血清 HBV DNA 和 RNA 的共同持续消失（低于检测下限） [26] ，并提出了从“部分治愈”、“准临床治愈”、再到“临床治愈”( 或“功能性治愈”) 的阶梯性提升模式，以 cccDNA 消失或静默为基础、以 HBV DNA 和 HBV RNA 持续阴性为依据的“部分治愈”预测 NAs 停药后复发或病毒学反弹风险。但鉴于停止抗病毒治疗后 HBV DNA 的反弹及疾病复发率，目前缺少大规模、多中心、前瞻性的研究的研究。值得关注的是，将 HBV RNA 联合 HBcrAg、HBsAg 及其他血清学标志物建立预测停药复发的试验模型有望进一步研究。
四、
展望
目前，随着 HBV 感染复制过程、机制的详细阐述，HBV RNA 在病毒复制过程中的作用也逐渐被阐明。在整个复制过程中，cccDNA 作为模板转录成 HBV mRNA。其中，pgRNA 作为逆转录、逆转录酶蛋白及其他蛋白合成的模板进一步完成病毒学复制 [27] 。此外，越来越多的检测方法可用来检测血清 HBV RNA，比较常用的方法有基于 RACE 的 PCR 法（cDNA 末端快速克隆，rapid - amplfication of cDNA ends） [28] 以及实时荧光定量 PCR（针对 HBV 基因组的 X，C 或 S 区设计特定引物，RT - qPCR） [29]，目前也有研究采用 QuantiGene assay [30] 、微滴数字化 PCR 法（droplet digital PCR，dd - PCR）测定血清 HBV RNA [31] 。
关于 HBV RNA 仍有许多问题暂未解决 ：（1）血清中HBV RNA 的分子学特征仍未完全揭示，有研究表明除了全长的 pgRNA，外周血清中可能还存在截短的 pgRNA，此类 RNA 可能使衣壳化的 RNA 不具有感染性 [32] ；（2）在 HBV 复制过程中，未经逆转录或者只经部分转录的 pgRNA 也可经过包膜蛋白装配，形成 HBV RNA 病毒样颗粒 [33] ，Wang 等 [17] 人发现具有缺陷的 HBV pgRNA 病毒样颗粒不具有感染性，血清中 HBV RNA 病毒样颗粒来源及在整个复制过程中的作用、是否具有感染性仍未完全阐明 ；（3）尚无研究比较分析各检测方法的差异，HBV RNA 检测方法的准确性、标准化仍值得进一步探究。在临床方面 ：（1）对于初治的 CHB 患者，HBV RNA 可以预测 HBeAg 阳性患者的血清学转换，为监测及个体化抗病毒治疗提供指导；（2）而长期接受抗病毒治疗后，HBV RNA 的价值需要考虑多种因素，如目前的感染状态、是否早期实现病毒学应答及是否发生血清学转换等来综合分析，其临床意义有待更深入的研究 ；（3）其对于长期治疗的患者安全停药的预测需进一步验证 ；（4）目前仅有少量针对孕产妇的研究 [34] ，缺少针对特殊人群 ：如肝癌患者、儿童等的研究，这也增加了其研究潜力。
总的来说，HBV RNA 作为一个新的血清学标志物，可与 HBV DNA、HBsAg、cccDNA、HbcrAg 等协同对乙型肝炎患者进行综合评估，优化目前对于乙型肝炎患者的监测及管理，其临床价值仍需要大规模、多中心、前瞻性的临床研究来进一步证实。
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