科研 | Plant Cell：中国农业大学：高时间分辨率的玉米籽粒发育早期转录组全景
编译：刘宁，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：High Temporal-Resolution Transcriptome Landscape of Early Maize Seed Development
译名：高时间分辨率的玉米籽粒发育早期转录组图谱
期刊：Plant Cell
IF：8.631（1区）
发表时间：2019.3.26
通讯作者：赖锦盛
通讯作者单位：中国农业大学、农业生物技术国家重点实验室、国家玉米改良中心、作物功能基因组和分子育种中心
DOI号：10.1105/tpc.18.00961
实验设计
玉米自交系B73自花受粉后手工解剖收集珠心（包括胚囊），每个时间点取2个生物学重复，每个生物学重复均来自至少3株植物。使用TRIzol试剂提取RNA，建库测序，比对B73参考基因组并分析。生成的原始数据上传NCBI的SRA数据库（登录号PRJNA505095）。
结果
1 玉米籽粒发育早期高时间分辨率转录组数据的产生
对双受精后144 h内的玉米自交系B73的珠心(包括胚囊)进行了RNA seq检测，间隔为4 h（0-72 HAP）或6 h （72-144 HAP；图1）。在所有31个时间点取2个生物学重复，每个生物学重复均来自至少3株植物。结果显示2个生物学重复的表达值高度相关（平均R2 = 0.94）。共检测到22,790个基因表达，其中包括1415个转录因子TF。
图1 授粉后（HAP）从0-144 h玉米籽粒的变化。来自31个不同时间点的珠心（包括胚囊）样品用于转录组分析。
对8个报道与早期玉米籽粒发育相关的基因的表达模式对转录组数据进行验证，其中ZmMCM3、ZmMCM6、ZmCYC1和ZmCYC3参与细胞周期过程，受精后被诱导，本研究中与报道结果相符。此外，其他报道过的基因如Esr2、Betl10、己糖转运蛋白基因ZmSWEET4C、生长素生物合成基因ZmYUC1等基因的表达动态与以前的报道一致，表明本研究得到的数据的可靠性。
2 高时间分辨率的转录组分为四个组分别对应不同的发育阶段
对31个样本进行层次聚类（图2A）和主成分分析PCA（图2B），结果与之前报道的早期玉米籽粒发育过程一致，分为4组—阶段I (0-16 HAP)，阶段II (20-44 HAP)，阶段III (48-96 HAP)和阶段IV(102-144 HAP)，分别对应双受精阶段、胚乳合胞体形成阶段、胚乳细胞化阶段和胚乳细胞分化起始阶段（图2C）。且对应特定阶段基因表达。
阶段I中编码与花粉育性有关的分泌肽ZmWAX2和谷氨酸脱羧酶仅在此阶段均高表达（图2D）。热休克蛋白（HSP）ZmHSP20和热休克转录因子（HSF）ZmHSF24在8 HAP后表达显著增加，在16 HAP之后降低（图2D）。
阶段II正如许多生物中所报道的那样，经典的H3基因在细胞周期的S阶段表达，并且依赖DNA复制。2个典型的H3基因ZmH3-a（Zm00001d042730）和ZmH3-b（Zm00001d045268）在玉米的胚芽期中主要表达（图2E）。拟南芥调节籽粒大小的WRKY10的同源基因ZmWRKY53和ZmWRKY104共表达（图2E），可能对玉米胚乳增殖很重要。
阶段III，与活跃的细胞分裂和细胞壁形成相一致，发现以下基因表达（图2F）：ZmExo1（Zm00001d017799）编码RNA核酸外切酶，可能与有丝分裂相关，对细胞周期进程协同调控；ZmLac（Zm00001d018601）编码一种漆酶，有助于高等植物的细胞壁重建；ZmTOM（Zm00001d040440）编码线粒体外膜（TOM）的转位酶，转运线粒体前体蛋白，在调节细胞周期中起着重要作用；ZmGCRP（Zm00001d028862）编码富含Gly和Cys的蛋白前体家族（GCRP），在细胞间信号传递中起着至关重要的作用。
阶段IV中主要表达基因包括（图2G）：胚乳特异性基因Esr1、MYB转录因子家族蛋白1（MRP1）、Betl3、糊粉蛋白（AL）分化有关的Al9，表明该阶段通常是由胚乳分化开始的。
图2 早期玉米籽粒发育的31个时间点之间的转录组关系。
（A）聚类树状图显示四个不同的发育阶段：围绕双受精、胚乳游离核期、细胞化和分化。
（B）31个时间点样本转录组的PCA。
（C）籽粒四个不同发育阶段的胚囊的图形表示。花粉管显示为橙色。精核显示为深蓝色。极核和胚乳核以红色显示。卵细胞和胚胎细胞以黄色显示。基底胚乳转移层细胞、糊粉细胞和胚胎周围区域细胞分别显示为浅蓝色、紫红色和绿色。
（D）至（G）标记基因主要在双受精（D）、多核体（E）、细胞化（F）和分化（G）的阶段表达。分别以浅黄色、蓝色、绿色和深黄色显示。
3 早期玉米籽粒不同发育阶段的基因表达
将所有22790个表达基因（包括1415个TF（6.2％））聚集到18个共表达模块中，然后进行注释模块的功能类别（图3），结果显示，属于前9个模块的基因主要在某一个发育阶段表达，代表其特定功能相应的阶段（图3A）。
3.1 双受精（阶段I）表达基因
双受精阶段（0-16 HAP）包含4453个基因，其中414 个TF，分布在模块I–A至I–D（图3A）。I–A模块（535个基因，51 个TF）包含一组与丝氨酸/苏氨酸激酶活性和磷酸化相关的基因（图3B），主要在0-4 HAP表达，与初始授粉反应有关。模块I–B（1718个基因，136个TF）基因主要在0-12 HAP时高表达（图3A），可能促进花粉管的生长（图3B）。
Ca2+信号在植物生长和发育中起重要作用，在模块I–B中涉及钙信号通路中的17个基因，包括Zm00001d031543，是拟南芥Ca2+ APT酶 9的同源蛋白，调控花粉管生长和受精。
I–C模块中的基因（1463个基因，122 TFs）在8-16 HAP时高表达，多为转录调控相关基因（图3B），包括7个MYB TF和5个与MYB相关的TF。此外，还有9种重要的植物特异性GARS TF和10种乙烯反应性APATELA2（AP2）-乙烯反应性元素结合蛋白（EREBP）TF。
在I-D模块中，737个基因，包括105个TF仅在约12 HAP时才高表达，表明其在受精后被短暂激活（图3A）。其中富含TF活性、转录调控和特定序列的DNA结合（图3B），表明其中的大多数可能是初期调控功能的关键。例如，模块I–D中的脂氧合酶-1（LOX1）、3个丝裂原激活的蛋白激酶（MPK）基因。
3.2 胚乳游离核期（阶段II）表达基因
在模块II胚乳游离核期（20-44 HAP）包括1285个基因（53个TF）（图3A），与DNA复制相关、转录起始因子活性、微管相关、核小体装配、核小体转录和DNA结合等过程相关（图3B）。组蛋白是染色质的主要蛋白质成分，玉米基因组中79个组蛋白基因中的66个出现在本研究数据中，其中有71％（47个）属于模块II（图4），其表达情况也与之前报道及功能相似。
3.3 胚乳细胞化阶段（阶段III）表达基因
在模块III-A和III-B中，胚乳细胞化阶段（48-96 HAP）包括2569个基因表达（125个TF）（图3A）。在整个细胞化阶段（48-96 HAP；图3A），III-A模块中的基因（1343个基因，73个TF）被高度表达，包括14个生长素途径基因，表明生长素转运蛋白和应答基因在胚乳细胞化中的重要性。 III-B模块中的基因（1226个基因，52个TF）主要在细胞化晚期（72-96 HAP）表达，富含与膜和蛋白质结合有关的基因，可能与细胞化过程中细胞膜的形成有关（图3B）。
3.4 分化阶段（IV期）表达基因
初始胚乳分化阶段（102-144 HAP）包括模块IV–A和IV–B中的3614个基因（包括224个TF）（图3A）。 IV-A模块中的基因（1357个基因，81个TFs）约在102 HAP中高表达（图3A），而IV-B模块中的基因（2257个基因，143个TFs）约在114 HAP中高表达。这些基因可能主要参与分化，包含了许多在胚乳亚区域中特异性表达的基因。
3.5 在多个阶段表达的基因
在模块M10-M18中，总共有10,869个基因（包括599个TF）在4个阶段中的1个以上进行了表达（图3A），表明在不同阶段中存在一些共同的功能过程。例如， M10富含与微管相关复合物有关的基因，在受精和游离核阶段（0-44 HAP）显示连续表达，这与有关微管相关复合物参与受精、有丝分裂和细胞分裂的报道一致。与叶绿素生物合成过程有关的基因在M10中高表达。这些发现表明光合作用系统可能在玉米籽粒的早期发育中开始的。玉米通常被认为是对冷敏感的物种，本研究发现与恒温性、冰晶结合和对冰冻反应相关的基因在M13中富集，并在受精、游离核和细胞化阶段持续表达（0-96 HAP；图3A）。结果表明，这些冷响应基因可能起到稳定膜的作用，以抵抗冷诱导的伤害，并有助于籽粒在最适温度条件下发育。
另外，如M16所示，在双重受精后激活了包括27个TF在内的1338个基因，并在II至IV阶段连续表达。这些基因包括许多基本生物过程，包括核糖体的结构组成、细胞质、翻译、细胞内翻译延伸、核糖体小亚基、GTPase活性、RNA结合、蛋白质分解代谢以及囊泡介导的转运过程。
4 涉及玉米籽粒早期发育4个阶段的特异基因，包括TFs及其靶基因
与23种已发布的非籽粒转录组数据相比，鉴定了共1093个在籽粒中特异性表达的基因，其中包括未发现的654个基因。这可能是因为本研究取样时间点更多的原因。这些特异性基因约占所检测到的所有表达基因的6.20％。在本研究检测得到的1415个TF中10.1％（110个）是籽粒特异性TF。籽粒特异性基因和TF在分化阶段显著富集（102 HAP之后），反映了籽粒特异性基因和TF在分化过程中的重要作用。
进一步分析TF与潜在靶基因连接的基因调控网络（GRN），包含14,540个靶基因（包括1317个TF），共有31,256个相互作用。其中包括81个籽粒特异性TF和1483个潜在靶基因，共2000个相互作用。不出所料，籽粒特异性基因更多的受到了籽粒特异性TF的调控。
接下来，进一步研究在胚胎和胚乳的后期发育阶段确定的1093个籽粒特异性基因的表达模式（图5；表1）。
4.1 双受精（阶段I）表达的特异性基因
第I组中的160个籽粒特异性基因（包括18个TF）主要在双受精（0-16 HAP；图5）表达，包含转录因子活性、酶抑制剂活性、序列特异性DNA结合、果胶酯酶活性和水解酶活性有关的基因表达增加，这可能与保护雌性细胞免受各种生物胁迫有关。I组中的13个籽粒特异性TFs在GRN中共有148个相互作用，连接最多的5个籽粒特异性TF是HSF24、HSF20、EREB117、BZIP29和GRAS61。HSF24和HSF20分别与32和24个基因相互作用，可能是热休克转录反应的主要调控因子，并且在玉米籽粒的双受精中起重要作用。
4.2 胚乳游离核期（阶段II）表达的特异性基因
第II组包含22种籽粒特异性基因，主要在胚乳游离核期表达（20-44 HAP；图5），其中包括含BURP结构域的蛋白质-RD22-like9（BURP9）。ZmCoenocyte4（ZmCoe4）是唯一在籽粒细胞形成过程中主要表达的籽粒特异性TF，它编码WRKY家族TF），预测与16个基因相互作用。
4.3 胚乳细胞化阶段（阶段III）表达的特异性基因
第III组包括112个籽粒特异性基因（7个TF），主要在细胞化阶段表达（48-96 HAP；图5）。包括Zea AGAMOUS同系物2（ZAG2）在授粉后表达增加，尤其是在细胞化阶段，但其功能尚未可知。最多的5个籽粒特异性TF是MYB131、MYB16、BZIP109、ZAG2和BZIP114（图6A）。预测MYB131、MYB16和BZIP109分别与109、83和51个基因发生相互作用，其潜在的靶基因有重叠（图6A）。预测18个基因受到MYB16和BZIP109的调控；17个基因受MYB16和MYB131调控。另外，预测类似多药耐药的ABC转运蛋白基因Zm00001d008178同时受到MYB16、BZIP109和MYB131的调控。预测总共有206个基因（其中89％（182个基因）主要在细胞化阶段表达）与MYB131、MYB16和/或BZIP109相互作用，形成的调控作用网络可能对细胞化很重要。
4.4 分化阶段（IV期）表达的特异性基因
鉴定出的籽粒特异性基因约一半（52％，569/1093）在胚乳分化过程中（102-144 HAP）高表达，结合其表达模式可以进一步分为两个亚组（图5）。
IV–A组中392个基因包括44个TF，在6、8 DAP高表达，然后降低（图5）。其中有51.8％（203/392）为籽粒亚区域特异性基因，约77％（157/203）在胚乳特定区室中特异性表达，表明IV-A组中的基因可能在胚乳细胞类型分化中起重要作用。有趣的是，发现与防御反应相关的基因在IV–A组中表达增加。例如防御素基因Esr6、BETL特异基因包括Ebe、Betl3和Bap2等。进一步解析基因功能可能有助于理解胚乳发育早期新分化组织中防御反应机制的建立。IV组中连接最多的5个籽粒特异性TF是ARF17、MYBR81、MYB80、BZIP46和HB118，且都在IV-A组中，预测分别与73、67、53、48和48个基因相互作用（图6B）。
与IV-A组的基因相比，IV-B组的基因（177个基因，包括16个TF）从初始分化到胚乳成熟持续表达（图5），这表明IV-B组的基因可能主要参与持续分化过程中的特定生物学过程。例如，IV-B中的ZmSWEET4C编码了一种己糖转运蛋白，将细胞壁转化酶催化产生的己糖转移到BETL中或穿过BETL，这是鼓粒的关键步骤。IV–B中的Floury3（FL3）编码植物富AT序列和锌结合家族蛋白，可以通过与RNA聚合酶III的相互作用来调节tRNA和5S rRNA的合成，这可能是胚乳发育和灌浆的基础。Trp氨基转移酶相关1（ZmTar1）和ZmYUCCA1（ZmYUC1）这两个基因，它们参与了IAA生物合成的不同Trp依赖性途径，都对玉米胚乳中IAA稳态的高度复杂调控非常重要。IV–B组有13个注释的TF和3个未知TF。总的来说，在IV–B组中籽粒特异性基因和TF对灌浆过程至关重要。
4.5 在多个阶段表达的特异性基因
在4个阶段中的1个以上中表达230个籽粒特异性基因，包括24个TF，它们可以进一步分为两组（图5）。第6组中的基因（187个基因，22个TF）在0-144 HAP均高表达，之后降低（图5），主要与细胞壁组织、有性生殖和天冬氨酸型内肽酶活性有关。第7组的基因（43个基因，包括2个TF）在籽粒发育的后期表达，且整体表达水平明显高于胚乳期，可能主要与胚胎中发生的特定生物学过程有关。
结论
本研究通过从0-144 HAP的31个时间点以4小时（0-72 HAP）或6小时（72-144 HAP）的间隔进行采样，构建了早期玉米籽粒发育的高时间分辨率动态转录组全景。动态转录组数据清楚地证明了早期籽粒内的四个关键发育阶段，包括双受精、胚乳游离核期以及胚乳细胞化和分化的阶段，分别有4453、1285、2569和3614个基因表达（表1）。鉴定得到的大量基因为将来对功能的研究提供丰富的资源，可以进一步了解早期籽粒发育的遗传调控机制。特别是，本研究检测到了1093个籽粒特异性基因，其中包括110个TF，未来将成为功能基因组学研究的目标。例如，通过GRN分析发现籽粒特异性TF：MYB131、MYB16和BZIP109可能对胚乳细胞化至关重要，MYBR81、BZIP46和HB118可能在胚乳分化中起关键作用。但这些籽粒特异性基因在早期籽粒发育中的确切作用仍有待进一步确定。
评论
玉米籽粒的发育过程复杂，了解其时空基因表达谱有助于玉米的遗传改良。通过多年努力，对籽粒发育过程中部分基因功能有了一定的了解，但对其他大部分基因的表达和功能等信息尚未明确。之前也通过转录组研究对其进行分析及基因功能的挖掘，但由于取样时间间隔较长，某些特定发育阶段短时间表达变化的基因很难捕捉，导致未能对玉米籽粒发育相关基因进行全面解析。本研究对双受精后6天内的B73籽粒发育样本进行间隔4-6小时的密集取样，绘制了玉米籽粒早期发育过程中基因表达的高时间分辨率的转录组图谱。其提供的转录组数据及挖掘得到的关键基因（阶段特异性基因），为深入解析玉米籽粒发育的遗传控制机制奠定了基础。
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