编译：阿菲，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
肾间质纤维化（RIF）是目前公认的慢性肾脏病（CKD）发病机制之一。抗纤灵（KXL，抗纤维蛋白）是一种已被证明能显著降低ECM沉积水平和抑制肾纤维化的中药。为了明确KXL的作用机制和药物靶点，作者建立了RIF大鼠模型，并用KXL和氯沙坦治疗。采用组织学分析RIF模型的建立和KXL的治疗效果。对肾组织进行了lncRNA、mRNA和microRNA测序，获得了多水平的转录组数据集。通过功能注释和通路分析来阐明其治疗机制。构建了一个多水平转录调控网络，以阐明纤维化发病机制和治疗调控的核心因素。KXL和氯沙坦能显著降低RIF的进展，且KXL浓度越高疗效越好。根据RNA-seq数据的聚类分析结果，正常对照组（NC）和高浓度KXL（HK）处理组的差异表达基因最接近。WNT、TGF-β和MAPK通路丰富并主导了RIF的发病机制和治疗。在纤维化模型中，miR-15b、miR-21和miR-6216上调，miR-107下调。这些小RNA在上述纤维化相关基因的调控中起着关键作用，并可被KXL治疗所抑制。最后，基于lncRNA数据集，作者构建了mRNA-lncRNA-miRNA共表达ceRNA网络，确定了肾纤维化发病机制中的关键调控因素和KXL的治疗机制。作者的研究揭示了中药抗纤灵抑制肾间质纤维化的潜在机制，支持了KXL治疗肾纤维化的临床应用。
原名：Transcriptomic analysis of the mechanisms of alleviating renal interstitial fibrosis using the traditional chinese medicine Kangxianling in a rat model
译名：转录组学揭示了中药抗纤灵减轻大鼠肾间质纤维化的作用机制
期刊：Scientific reports
IF：3.998
发表时间：2020.06.30
通讯作者：何立群&朱思博
通讯作者单位：上海中医药大学附属曙光医院
DOI号：10.1038/s41598-020-67690-3
图1 实验设计与分析流程。SD大鼠分为对照组和RIF模型组。模型大鼠进一步分为5组（每组5只）：模型验证组、OC组（RIF假对照）、HK组（高浓度KXL）、LK组（低浓度KXL）和LOS组（氯沙坦治疗）。模型验证组大鼠行肾组织病理切片染色。NC组（假对照组）接受假手术和空车治疗。组织学分析证实了RIF模型的建立和KXL的治疗效果。利用肾组织lncRNA、mRNA和microRNA测序，生成多水平转录组数据集。应用功能注释和通路分析来阐明其治疗机制。构建多水平转录调控网络，以阐明纤维化发病机制和治疗调控的核心因素。
慢性肾脏病（CKD）是一种慢性疾病，其特征是肾功能在数月或数年内逐渐和不可逆地丧失。随着人类预期寿命的延长和糖尿病、高血压发病率的增加，CKD的发病率在全球范围内呈上升趋势。2012年的一项研究发现，中国人群中CKD的发病率为10.8%，据世界卫生组织（WHO）统计，2012年死于CKD的人数为864226人（死亡率为1.5%），已成为公共卫生资源的沉重负担。肾间质纤维化（RIF）和肾小球硬化是CKD发病和发展的重要病理生理机制。此外，有研究表明，RIF的程度与肾小球硬化及肾功能密切相关。RIF的形成机制目前还不完全清楚，但一般认为它与细胞外基质（ECM）合成失调有关。最近的研究也表明上皮间充质转化（EMT）是RIF形成的重要机制之一。肾小管纤维化是由细胞因子过度表达，通过分泌细胞间基质调节肾间质细胞失调，破坏肾组织结构，最终导致肾功能衰竭的病理过程。细胞因子是肾纤维化过程中的关键因子，通过多种信号途径控制肾纤维化相关基因的转录。肾纤维化信号通路包括转化生长因子-β/Smad转导（TGF-β/Smads）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶级联（MAPK）信号通路和腺苷信号通路。其中TGF-β/Smads与肾纤维化的关系最为重要。TGF-β主要通过其下游信号分子Smad2/3抑制Smad7以调节肾纤维化。研究还表明WNT信号通路参与组织损伤，并在肾纤维化的进展中起重要作用。在中药抗肾纤维化治疗中，核心治疗策略是重建肾脏的微环境。研究表明活血化瘀汤通过上调一氧化氮合酶从而上调一氧化氮含量，进而导致TGF-β1表达下调，减轻肾间质纤维化。这一途径被证明可以延缓肾小球硬化的发病机制，对肾脏起到保护作用。抗纤灵（KXL，抗纤维蛋白）是一种传统的中草药配方，可显著降低血清肌酸、总胆固醇和ECM沉积水平，并抑制肾纤维化。在以前的临床研究中，KXL显著降低血清肌酐（Scr）和血尿素氮（BUN）水平，并延缓慢性肾功能衰竭的进展。KXL显著降低早期中期慢性肾功能衰竭（CKD2-3）患者的肌酐和尿素氮水平，并被广泛用于治疗早期中期慢性肾功能衰竭。基于以上文献研究，作者假设KXL的抗纤维化作用是由转录组的变化来调节的。然而，KXL的作用机制和作用靶点尚不清楚。因此，建立了KXL联合氯沙坦治疗的肾纤维化模型，为了解KXL的抗纤维化分子功能提供了新的思路。
1 肾纤维化大鼠模型
与OC组相比，KXL治疗组和LOS治疗组的BUN、Scr和24h尿蛋白表达水平均下降。随着KXL剂量的增加，疗效增强。HK组疗效优于LOS组（表3）。在RT-PCR检测和western blot分析中也发现了相同的趋势，如TGFβ1、Smad3、a-SMA、Col1a1、Col1a2和FN（图2）。与OC组相比，HK组和LOS组的GSI和TII得分显著降低（图3）。HK组与LK组比较，得分明显下降。Masson染色显示，NC组仅在血管和基底膜中有绿色染色的胶原纤维，间质成分相对较少。OC组胶原含量增加，间质细胞大量浸润，绿色胶原纤维明显增多。HK组和LOS组胶原纤维成分及间质细胞浸润程度均低于OC组。
表3 KXL对血清肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）及24h尿蛋白排泄的影响。数值为平均值±标准差。*表示与OC比较的组，#表示与NC比较的组。*代表p<0.05，**，##代表p<0.01，***，##代表p<0.001。
图2 RIF模型的验证。（a） 检测各组肾纤维化相关基因TGF-β1、FN、Smad3、Col1a1、Col1a2和α-SMA的表达水平。各组均与OC比较。*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001。（b） TGF-β1、Smad3、a-SMA、FN、Col1a1和Col1a2的免疫印迹分析。
图3 大鼠RIF的病理学分析。（a） HE染色（400×）。（b） Masson染色（400×）。（c） 各组的Masson评分、GSI和TII。各组均与OC比较。*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001。
2 mRNA分析
T-SNE图显示了各组之间的明显区别（图4a）。通过HCA，作者观察到不同实验组的样品分离良好，具有良好的生物重复性（图4b）。在各组中，NC和OC在DEGs数目方面的差异最大，而NC和HK治疗组最接近，表明KXL治疗的疗效（图4c-d）。病理染色评分与图4e中PC1维度的相关性分析表明，测序结果与病理结果基本一致。DEGs和热图分析显示，Smad7、Wnt16和Map3k15，在KXL（高剂量）治疗下显著改变，类似于NC、OC和KXL的比较（图5a）。此外，还进行了KEGG通路分析和DEGs基因功能富集。路径分析证实，纤维化的发病机制和抗纤维化过程与Wnt信号通路（rno04310:WNT1、TBL1XR1、WNT7B、WNT16、PLCB4）、TGF-β信号通路（rno04350:AMHR2、PPP2R1B、SP1、ROCK1、SMAD7、SMURF1、BMP7）、NFκB途径（rno04064:MAP3K7，DDX58，VCAM1，LAT，XIAP，RIPK1）和MAPK信号通路（rno04010:MEF2C、NF1、RELB、CACNB1、CACNB2、STK4、DAXX、TAB2、TGFB2）（图5b），而GO分析也显示，在KXL治疗中，MAPK、PI3K和TGF-β功能富集。
图4 mRNA分析。（a） 所有样本的层次聚类分析。（b） 所有样品的T-SNE图。（c） 每组的特征值。（d） DEGs的数量。（e） PC1与病理学评估相关。
图5 KXL治疗肾转录组的功能分析。（a） 高剂量KXL治疗相关基因的热图。（b） KXL治疗相关途径的KEGG途径分析。（c） KXL治疗相关功能注释的GO分析。
3 KXL治疗相关miRNAs靶基因及功能分析
对miRNA数据集的DEG分析显示，miR-15b、miR-21和miR-6216在纤维化模型中上调，在KXL治疗后下调。miR-107在纤维化肾脏中表达下调，在药物治疗后上调，这意味着miR-107在抑制肾纤维化方面的重要作用（图6a）。通过数据库比对，筛选出与miRNA表达异常相对应的靶基因，并对靶基因进行KEGG途径分析。如图6b所示，FoxO信号通路，MAPK信号通路和Wnt信号通路与miRNAs在纤维化调节中作用的靶基因显著相关。作者用mRNAs和miRNAs的DEGs构建了一个miRNA -mRNA共表达网络，其中Smad7、Map3k15、Gapt、Tmlhe和Wnt16等94个基因均满足阴性表达相关系数低于-0.8标准（图6c）。RT-qPCR结果显示miR-107模拟物可抑制HEK293细胞Smad7的表达。此外，miR-107抑制剂抑制内源性miR-107，使HEK293细胞中Smad7的表达增加。因此，认为miR-107可以下调HEK293细胞中Smad7的表达。同样，作者发现miR-15b可以下调HEK293细胞中Tmlhe的表达（图6d）。
图6 KXL治疗相关miRNAs靶基因及功能分析。（a） 高剂量KXL治疗相关基因的热图。（b） KXL治疗相关miRNA靶基因的KEGG途径分析。（c） 负调控miRNAs及其靶点包括Smad7、Gapt、Tmlhe和Wnk2。（d） miRNA靶基因的验证。*代表p<0.05，**代表p<0.01。
4 KXL治疗相关ceRNA网络分析
在lncRNA分析中，作者发现共有1986个非编码基因参与了基因间的调控。基于lncRNA-miRNA的表达模式，建立了一个潜在的ceRNA调控网络。在作者的分析中，miRNAs被认为是由lncRNAs调节以达到抑制或促进MRNA的目的。ceRNA网络基于三个显著富集的miRNAs构建，即miR-6216、miR-107和miR-15b（图7a）。关于KXL的纤维化机制和治疗效果，作者放大了miR-107相关网络，发现多个上调的lncRNAs，如NONRATG0020924.2，被富集以减少miR-107的丰度，并进一步增强抗纤维化相关基因的表达，包括Smad7、ROCK1和Wnt16（调整后的p值<0.05）（图7b）。
图7 RIF肾脏中基于治疗的mRNA lncRNA-miRNA-ceRNA网络。（a） 以miR-6216、miR-107和miR-15b为基础的三个关键的基于miRNA的ceRNA网络在KXL治疗模型中连接起来，并在ceRNA网络中得到丰富。（b） 在KXL治疗相关基因分析中，多个上调的lncRNAs被富集，减少了miR-107的丰度，进一步增强了Smad7、ROCK1和Wnt16的表达。蓝色节点表示mRNA。橙色的节点代表miRNAs。粉红色的节点代表lncRNAs。边缘宽度表示调整后的−log（p值），红色表示上调，蓝色表示下调。
在该研究中，作者在中药KXL对肾间质纤维化大鼠模型研究中发现了其有效的抗纤维化作用。然而，在推广古老而有效的疗法时，主要关注的是对方剂作用机制的解释。本研究通过多组学测序分析，阐释了本研究中KXL的主要作用机制和疗效，发现了1800多个信号基因,包括Smad7、Wnt16和Map3k15上调。这进一步触发了Wnt、TGF-β和MAPK通路的下游激活。Surenden等人报道了Wnt家族基因在小鼠单侧输尿管梗阻模型（UUO）中的作用。大量研究表明Wnt信号通路并不独立存在并调节肾纤维化，而是与多种因子及其他信号通路相互作用。Wnt/βcatenin、RTK/Ras/MAPK和PI3K/ILK/PKB途径相互作用，促进EMT。在RIF的miRNA分析中，miR-15b、miR-107、miR-21和miR-6216在肾纤维化的发病机制和治疗中起着重要作用。miR-107的失调能抑制PTEN上调和PI3K信号抑制导致细胞迁移和侵袭。miR-107的过度表达调节VEGF35的表达。阻断miR-21/PTEN/PI3K通路也可以抑制RIF中的EMT过程。miR-15家族为一种新的心肌纤维化调节因子，通过抑制TGF-β途径发挥作用。血管紧张素Ⅱ（Angiotensin II，ANGⅡ）是慢性肾损伤后肾纤维化的主要致病因素。氯沙坦是与AT1受体结合的ANGⅡ拮抗剂。氯沙坦对5/6肾次全切除大鼠有肾保护作用。He等人的研究结果。表明氯沙坦通过阻断STAT3磷酸化来减轻UUO大鼠模型的肾纤维化和肾小管细胞凋亡。病理评估结果显示，高剂量的KXL治疗RIF比氯沙坦有更大的益处。测序结果获得DEGs数目和富集途径进一步证实并解释了其作用机制。基于lncRNA、mRNA和miRNA的分析，建立了一个潜在的ceRNA调控网络。一些上调的lncRNAs，包括非RATG0020924.2，在肾纤维化中富集。通过干扰该网络，减少Smad和Wnt基因等纤维化因子的表达，也可以达到抗纤维化的效果。作者首次阐明了差异表达的mRNAs和lncRNAs的相关性并描述了mRNA-miRNA-lncRNA-ceRNA网络在抗纤维化治疗的发病机制和治疗中的作用。TGF-β/Smad网络在肾纤维化中起着重要作用，在各种肾脏疾病模型中，Smad7已被证明是肾纤维化的治疗剂。lncRNA/miRNA/mRNA相互作用的CeRNA网络在纤维增生中显示出更普遍和更重要的调节作用。这些监管网络研究得出了与我们类似的结论。近年来，中药不仅在中国得到迅速应用，而且在世界上许多国家也得到了迅速的应用。在该研究中，作者建立了肾脏RIF的中医治疗模型，并用多组学方法解释了KXL的治疗效果。这些结果支持了KXL在临床上的应用。该文作者采用多组学的方法阐释了KXL的治疗作用机制。首次阐明了差异表达的mRNAs和lncRNAs的相关性并描述了mRNA-miRNA-lncRNA-ceRNA网络在抗纤维化治疗的发病机制和治疗中的作用。阐明中药的药理机制能极大促进其在临床上的应用，促进中药的应用。
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