科研 | Nature Cell Biology：结合单细胞和空间转录组学揭示分子、细胞和空间骨髓生态位组织
编译：不二，编辑：十九、江舜尧。
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骨髓是血液生成和骨骼再生的主要部位。但是，其细胞和空间组织定位仍存在争议。本研究结合单细胞和空间转录组学系统地揭示了不同骨髓生态位的分子、细胞和空间组成。研究者对所有主要的骨髓细胞类型进行转录分析，鉴定其空间定位并阐明造血因子的来源。本研究数据表明，Cxcl12富集表达的网状（CAR）细胞亚群（Adipo-CAR和Osteo-CAR）在窦状小管和小动脉表面差异分布，并在局部充当“专门产生细胞因子的细胞”，从而建立了血管周围的微生态位。重要的是，对单细胞转录组数据使用RNA-Magnet算法可以准确推断三维骨髓组织。总之，研究揭示了骨髓生态位的细胞和空间组织定位，并提供了系统的方法来解析整个复杂的器官组织。
论文ID
原名：Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization
译名：结合单细胞和空间转录组学揭示分子、细胞和空间的骨髓生态位组织
期刊：Nature Cell Biology
IF：17.728
发表时间：2019.12
通讯作者：Lars M. Steinmetz，Andreas Trumpp和Simon Haas
通讯作者单位：欧洲分子生物学实验室和德国海德堡干细胞技术与实验医学研究所
DOI号：10.1038/s41556-019-0439-6
实验设计
本研究以8-12周的C56BL/6J雌鼠作为实验材料，收集股骨、胫骨、臀骨和脊椎等，冲洗骨髓（BM）或者压碎骨头收集细胞。使用流式细胞荧光分选技术（FACS）分选细胞，分别进行单细胞测序（scRNA-seq）和基于FACS的index-scRNAseq。对骨头进行冷冻切片，利用激光捕获显微解剖结合测序（LCM-seq）的方法进行空间转录组学测序。对所有测序数据进行生物信息学分析，结果利用免疫荧光染色实验进行验证。
结果
scRNA-seq鉴定和表征骨髓（BM）细胞类型
由于各种BM细胞类型的含量相差几个数量级，这对scRNA-seq方法是个挑战。为了同时捕获丰富的和稀有的BM细胞类型，研究者从小鼠BM中进行了基于液滴的细胞scRNA-seq，然后从未消化的BM或酶消化的骨骼中逐渐消耗丰富的细胞类型或富集稀有的细胞类型（图1a）。总的来说，数据集包含了7497个细胞，它们形成了32个细胞簇，分别对应于不同的细胞类型或不同的分化阶段（图1b）。由于不同细胞类型之间的解离速率差异很大，因此该图谱对于不同细胞类型群体的相对大小不是定量的。基于标记基因的表达、GO分析和转录组数据中细胞簇标记基因的富集定量，进行细胞类型的注释，使用CIBERSORT算法对已报道的细胞种群进行分析。使用SOUP证实此处的间充质细胞群体包含不同的细胞类型，并且细胞簇之间存在过渡状态。
图1 scRNA-seq鉴定的BM细胞类型。
如预期的那样，总BM的scRNA-seq鉴定了主要的造血细胞类型，包括树突状细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、T细胞和不同发育阶段的B细胞（图1b）。随着消耗这些主要的免疫细胞种群，scRNA-seq鉴定了幼红细胞的祖细胞，该祖细胞表现出泛造血细胞标记基因CD45的低表达，并表现出幼红细胞标记基因的表达，例如CD71。这些细胞中另外2％为非造血细胞（图1a）。为了深入捕获非造血细胞，随后从未消化的BM和酶消化的骨骼中去除了表达细胞谱系标记基因CD45或CD71的细胞（图1a）。鉴定了稀有细胞种群，包括Schwann细胞（Mog，Mag）、平滑肌细胞（Tagln，Acta2）、成纤维样细胞、9种不同的Pdgfra阳性间充质细胞种群和两个内皮细胞（EC）簇（Cdh5）。内皮细胞种群包括表达Sca1（Ly6a）的动脉EC和表达Emcn的窦状小管EC（图2a，b）。间充质细胞谱系包含软骨细胞（Acan，Sox9）、成骨细胞（Osteocalcin/Bglap，Col1a1）和几种不太好的描述的细胞类型。这些包含3个不同的成纤维样细胞种群，研究者根据它们的空间定位进行了注释，以及另外2个与已报道的SCF-绿色荧光蛋白（GFP）+和Cxcl12-GFP+高度转录组相似性的Cxcl12富集表达的网状（CAR）细胞（图2c）。值得注意的是，尽管总体转录组谱相似，但后两个细胞群体差异表达了脂肪细胞和骨细胞谱系基因（图2d）。因此，将这些细胞亚群分别称为“Adipo-CAR”和“Osteo-CAR”细胞。Adipo-CAR细胞表达高水平的瘦素受体（Lepr），并与LepR–Cre细胞表现出高度的转录组相似性（图2c，d）。相反，Osteo-CAR细胞表达较高的osterix（Sp7；图2d）和较低的Lepr水平。最后，鉴定了表达Ng2和Nestin的间充质细胞簇，这些细胞与已报道Ng2+Nestin+的MSC细胞表现出转录组相似性，研究者将其称为“Ng2+ MSC”（图2a，c）。使用RNA-Velocity的伪时间分析将Ng2+ MSC置于分化等级的最高点，下游为成骨细胞、CAR细胞、软骨细胞和成纤维细胞（图2e）。
另外，进行了Lin-cKit+细胞的scRNA-seq来全面覆盖造血干细胞和祖细胞（HSPC）群体。这揭示了巨核细胞-红细胞和淋巴-髓样细胞分支以及嗜酸性粒细胞/嗜碱性粒细胞的祖细胞的连续分化（图1b）。
为了评估scRNA-seq实验中细胞解离对细胞类型恢复的影响，研究者比较了冲洗BM与压碎全骨以及有无酶消化的分离。在冲洗和压碎的BM中都发现了大多数细胞种群，但是许多细胞群仅在经过严格的物理处理或酶消化后才能有效释放（图2f）。与冲洗的骨头相比，压碎的骨头中的成纤维细胞、肌成纤维细胞和Schwann细胞含量更高。尽管通过成像和空间转录组学证实了骨干的BM中存在成纤维细胞亚群（图3和5），但来自整个骨骼的scRNA-seq数据也可能存在源自皮质骨、骨骺或骨膜的相似细胞类型。
总之，数据集涵盖了几乎所有已知的BM细胞类型以及一些未知的细胞类型。破骨细胞、神经元细胞和成熟的巨核细胞未包含在我们的数据集中，这可能是由于细胞大小的限制。完整的数据可以在http://nicheview.shiny.embl.de上浏览。
图2 BM细胞类型的表征。
结合单细胞和空间转录组学对BM细胞类型进行空间分配
尽管单细胞转录分析提供了强大的工具来表征BM细胞类型的身份和分子组成，但有关其空间分布的信息却丢失了。因此，研究者将scRNA-seq数据与BM的空间转录组学数据进行整合。开发了强大的激光捕获显微解剖结合测序（LCM-seq）的方法。使用这种策略，从LCM解剖的BM切片区域（在单个细胞层中包含200-300个细胞）生成了全长和高质量的转录组数据。根据是否存在窦状小管和小动脉血管或基于距骨内膜的距离，将LCM-seq应用于从骨干的BM收集的76个微解剖区域，以表征骨内膜、骨下膜、小动脉、窦状小管和非血管生态位组成（图3a）。
为了评估该方法，选择了各个位置已知的特异性细胞类型的标记基因，并比较了它们在scRNA-seq和相应的空间转录组学数据中的表达（图3b）。正如预期的那样，成骨细胞基因在骨内膜中选择性富集，窦状小管EC特异的基因在窦状小管的区域富集，而动脉内皮细胞基因在小动脉中富集。造血细胞种群、Schwann细胞和成肌纤维细胞的标记基因与任何已定义的生态位均无显著相关性，表明这些细胞类型在生态位（造血细胞种群）中分布相对均匀，或者在LCM-seq数据（Schwann细胞和成肌纤维细胞）中覆盖不足（图3c）。相反，其余12个细胞种群的标记基因表达在各个生态位之间存在显著差异（图3c）。
为了系统地评估这些BM细胞类型对候选生态位的优先定位，使用CIBERSORT算法估计了空间解析的转录组学数据中scRNA-seq定义的细胞种群的出现频率（图3d–f）。以单细胞为参照，验证了CIBERSORT分解转录组的能力，并评估了其对已知组成的100个细胞的组装能力。正如预期的那样，仅在骨内膜生态位发现了成骨细胞和软骨细胞（图3e，f）。另外，特异的成纤维细胞种群优先定位于骨内膜，因此暂定为“骨内膜成纤维细胞”。相比之下，动脉EC、平滑肌细胞和独特的成纤维细胞则专门定位于小动脉生态位（图3e，f）。研究者将这种成纤维细胞群称为“小动脉成纤维细胞”。窦状小管EC出现在窦状小管生态位中，但也存在于骨内膜生态位中，这与整个BM上广泛分布的窦状小管一致（图2b）。Adipo-CAR细胞也主要在窦状小管发生区域发现，这与它们和LepR-Cre细胞的相似性以及已报道的这些细胞类型的窦状小管定位相一致。相反，以前未报道的Osteo-CAR细胞则优先定位于小动脉或非血管生态位，表明这两个CAR细胞种群占据着不同的生态位。无法将Ng2+ MSC全体一致地分配给一个生态位，这可能是由于该细胞种群内的其他异质性。总而言之，空间转录组学与单细胞转录组学数据的系统整合，使研究者能够将大多数已知的以及以前未知的BM细胞群体定位于不同的骨内膜、窦状小管、小动脉和非血管生态位。
图3 通过整合单细胞和空间转录组学对BM细胞类型进行空间分配。
细胞类型定位的验证
为了确认通过LCM-seq鉴定的BM细胞类型的空间关系，研究者验证了各个特异细胞类型的标记基因，并进行了骨切片的免疫荧光成像。
基因表达分析表明，碱性磷酸酶（Alpl）和Cxcl12的表达可区分Osteo-CAR细胞（Cxcl12+Alpl+）、Adipo-CAR细胞（Cxcl12+Alpl-）和Cxcl12-Alpl+细胞类型，例如成骨细胞、Ng2+ MSC和动脉EC（图4a）。为了验证Adipo-CAR细胞和Osteo-CAR细胞的原位定位，我们对Cxcl12-GFP小鼠的长骨进行了免疫荧光成像。与窦状小管标记基因Emcn共染色显示，中央BM中的Cxcl12+Alpl-的Adipo-CAR细胞主要包被窦状小管，这与LCM-seq的结果一致（图4a）。相比之下，中央BM中的Cxcl12+Alpl+的Osteo-CAR细胞则表现出非窦状小管定位和高度网状形态（图4a-e）。重要的是，在Sca1+GFPdim小动脉的附近也经常观察到Cxcl12+Alpl+Sca1low的Osteo-CAR细胞，其中GFPhigh的Osteo-CAR细胞覆盖了小动脉血管（图4f）。这些结果定量地证实了Osteo-CAR细胞是非窦状小管的定位，并且定性地证实了这些细胞定位于小动脉和非血管区域。骨内膜区域（可能源自成骨细胞）普遍存在Alpl染色，无法分析这些区域的CAR细胞群体。
图4 使用免疫荧光进行CAR细胞亚群的定位。
接下来，研究者使用CD31、SM22、Pdpn、Pdgfr、Col1a1和Sca1作为标记基因，鉴定和定位平滑肌细胞（SM22+Pdpn-）、成纤维细胞（Pdpn+Pdfgr+）、成骨细胞（Pdpn-Col1a1+）和动脉EC（Pdpn-CD31+Sca1+；图5）。如LCM-seq数据所示，表达CD31/Sca1的小动脉被SM22+Pdpn-平滑肌细胞和Pdpn+成纤维细胞包裹（图5a）。小动脉成纤维细胞似乎是小动脉周围外膜胶原层的细胞来源，并可能与已报道的小动脉周围表达Pdpn的基质细胞重叠。此外，免疫荧光证实Pdpn+Col1alow成纤维细胞定位于由Pdpn-Col1ahigh成骨细胞组成的骨内膜骨面向侧（图5b）。值得注意的是，在皮质骨和骨膜区域还发现了Pdpn+细胞，这增加了一种可能性，中央骨髓中类似的成纤维样细胞也源自BM的远端区域（皮质骨、骨骺或骨膜；图5c）。
这些数据一起证明了该方法能够识别以前未知的细胞类型（例如Adipo-CAR细胞和Osteo-CAR细胞），并在BM中进行空间定位。
图5 使用免疫荧光进行其他间充质细胞类型的定位。
基于scRNA-seq数据准确预测BM细胞类型的空间关系。
在复杂的器官（如BM）中如何建立和维持细胞类型的空间关系仍然知之甚少。已有研究提出，细胞粘附因子的表达代表了一种重要的机制，该机制将基本的遗传信息转化为组织中细胞复杂的三维模式。利用注释完好的细胞粘附因子受体及其同源细胞质膜蛋白或细胞外基质结合配体，并使用RNA-Magnet算法，以研究是否可以通过细胞粘附因子的差异表达来预测BM细胞群体的特异细胞类型定位。RNA-Magnet根据细胞表面受体及其同源表面结合蛋白的表达模式，预测单个细胞与选定的吸引种群（锚）之间的潜在物理相互作用。RNA-Magnet提供每个细胞的吸引强度得分（RNA-Magnet吸附力），并指示该细胞吸引种群的方向（RNA-Magnet定位）。为了研究RNA-Magnet是否能够概括BM细胞类型的空间关系，研究者引入了四个锚种群代表以下生态位：成骨细胞代表骨内膜生态位，窦状小管EC代表窦状小管生态位，动脉EC和平滑肌细胞代表小动脉生态位（图6a）。通过分析空间转录组学，不同生态位预测的BM细胞种群的粘附性与它们的差异定位程度密切相关（图6b）。几乎所有细胞种群的定位都得到了高度准确的概括（图6c），包括分别将Adipo-CAR细胞和Osteo-CAR细胞定位于窦状小管和小动脉内皮细胞。有趣的是，平滑肌细胞最易吸引到动脉EC，而小动脉成纤维细胞粘附在平滑肌上，重现了血管中观察到的连续分层，其中血管内膜（内皮细胞）被血管中膜（平滑肌细胞）和外膜（由小动脉成纤维细胞产生的细胞外基质）包围。这些结果表明RNA-Magnet可以从单细胞基因表达数据预测空间定位，并强调了细胞粘附蛋白对于BM组织分布的重要性。
图6 RNA-Magnet从单细胞基因表达数据中预测细胞相互作用。
BM中细胞因子和生长因子的细胞和空间来源
BM中的关键生物学过程是由多种细胞因子和生长因子的协同作用介导。然而，产生细胞因子的细胞身份及其在空间和功能BM生态位中的分布尚不清楚。研究者使用scRNA-seq数据集鉴定HSC维持因子来源的细胞。数据显示，Cxcl12和Kitl（Scf）在动脉EC和一些间充质细胞中表达。但是，它们在Adipo-CAR和Osteo-CAR细胞中的表达要高几个数量级（图7a）。为了在蛋白质水平上确认Adipo-CAR和Osteo-CAR细胞的Cxcl12表达，使用了流式细胞荧光分选技术（FACS）标记策略来区分这些细胞类型，并使用基于FACS的index-scRNAseq进行验证（图7b）。比较分析表明，Adipo-CAR细胞显示CD45-CD71-Ter119-CD41-CD51+VCAM1+CD200midCD61low，而Osteo-CAR和NG2+ MSC高水平表达CD200和CD61（图7c）。细胞内流式细胞仪分析证实，两个CAR细胞Cxcl12表达较高，而内皮细胞可以检测到但表达水平明显较低（图7d）。CAR细胞也表达B细胞和骨髓细胞谱系所需的关键细胞因子，例如Il7和m-CSF（Csf1；图7a）。在所有BM细胞类型中，CAR细胞表达多种不同的细胞因子和生长因子，并且很大部分都是细胞因子，表明它们充当了“专门产生细胞因子的细胞”（图7e，f）。总之，这些结果提出了一个模型，在该模型中专门产生细胞因子的细胞与细胞支架的不同定位导致了特定的微生态位的建立。与此一致的是，空间转录组学揭示了所研究的五个生态位显示出独特的传导信号产生模式（图7g，h）。重要的是，CAR细胞衍生的细胞因子主要在小动脉和窦状小管生态位中表达，与非血管生态位相比，血管生态位中生长因子和细胞因子表达更高，这与Osteo-CAR和Adipo-CAR细胞优先定位于各自的内皮支架相符合（图7g）。这些结果表明，专门产生细胞因子的BM细胞的特定定位导致独特的生态位建立，其中小动脉和窦状小管生态位均是产生HSC维持和分化因子的关键部位。
图7 BM中关键细胞因子的细胞和空间来源。
BM细胞类型的细胞间信号传导相互作用的系统分析
将RNA-Magnet应用于传导信号（例如细胞因子，生长因子等）及其受体，获得潜在的细胞间传导信号相互作用的系统概述（图8a）。与以前从单细胞数据构建信号网络的方法不同，RNA-Magnet结合了低表达的mRNA与表面受体信息，基于配体-受体特异鉴定了不同细胞类型之间的信号相互作用。
从RNA-Magnet分析获得的网络形成了两个信号簇，由成熟的免疫细胞或非造血细胞组成，表明免疫细胞和非免疫细胞优先在各自的细胞组内进行交流。例如，成骨细胞感知到的许多信号（例如，Bmp、PTHrP和FGF信号）由骨内膜成纤维细胞释放。与成熟的免疫细胞相反，HSPC细胞群体经常从非造血细胞接收信号，表明HSPC逐渐从间充质转变为免疫信号生态位。重要的是，两个CAR细胞群都是所有骨髓样和淋巴样祖细胞感知信号的最重要来源（图8a）。根据Osteo-CAR和Adipo-CAR细胞对小动脉或窦状小管支架的特定定位，不同局部生态位的信号输出的分析表明，骨髓样和淋巴样祖细胞从血管尤其是窦状小管生态位产生的细胞因子中获得了强大的信号输入（图8b，c）。总之，这些分析表明，不同的生物学BM进程由来自不同局部生态位的特定信号组合输入介导，并提供了BM中信号相互作用的系统视图。
图8 BM中信号的系统分析。
讨论
在这项研究中，研究者结合了单细胞和空间转录组学来定位所有主要的BM细胞类型，并将它们在空间上分配给不同的BM生态位。数据阐明了调节BM造血功能的关键细胞因子的细胞和空间起源。关键的HSC因子（例如Cxcl12和Scf）主要由两个截然不同且以前未被认识的细胞亚群产生，根据它们的基因表达谱，我们将其称为Osteo-CAR细胞和Adipo-CAR细胞。除干细胞维持因子外，CAR细胞亚群在所有BM细胞类型中产生最多的细胞因子，包括介导骨髓样和淋巴样细胞分化的主要细胞因子，这与最近的研究表明IL7和Cxcl12是由同一BM细胞类型产生相符。表明CAR细胞充当“专门产生细胞因子的细胞”，并构成协调不同方面造血功能的中枢生态位细胞。Adipo-CAR细胞位于窦状小管血管内皮，Osteo-CAR细胞则位于非血管区域或小动脉内皮。因此，与非血管和骨内膜生态位相比，在窦状小管和小动脉生态位中都可以观察到大量的干细胞维持和分化因子。总之，这表明小动脉和窦状小管血管支架均是产生HSC维持和分化所需因子的关键部位，其中Adipo-CAR细胞和Osteo-CAR细胞亚群构成了中枢细胞中心。
本研究数据支持一个模型，该模型通过专门产生细胞因子的细胞在细胞支架上的不同定位来介导独特的生态位的建立。与遗传研究的最新数据一致的是，不同的生态位环境可能会差异性调节造血活性。未来，研究对这种外部的生态位介导的变异是否会决定造血干细胞的早期命运将引起人们的兴趣。
评论
本研究方法结合了scRNA-seq和空间转录组学方法，揭示了BM生态位的分子、细胞和空间组织定位，并提供了系统的方法来解析整个复杂的器官组织。
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